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DNA产物纯化常见问题分析 solarbio

发表时间:2010-10-24  |  点击率:1167

 

DNA产物纯化常见问题分析
 

常见问题
可能原因
建议解决方案
未回收或回收率低
胶块未全部溶解
溶解凝胶时应该置于65℃水浴,不断上下颠倒,确定胶块完全溶解后再进行下一步操作。如果凝胶浓度较大,可增加溶胶液使用量。
胶块太大(>400mg)
如果需要处理的胶块太大,应该先将其切成小块,做两次回收或选用大量型回收试剂盒。
电泳缓冲液pH过高
硅胶膜在高盐低pH值时可结合DNA,在低盐高pH值条件下洗脱。如果电泳缓冲液pH值太高,会导致DNA无法结合或降低结合率,可在溶胶后加入3M NaAc (pH5.2),将pH值调至7.0以下。
漂洗液中未加入无水乙醇
*次使用之前应该在漂洗液中加入无水乙醇。漂洗液每次用后应该拧紧瓶盖,以免乙醇挥发,降低回收率。
洗脱液不合适
DNA只在低盐溶液中才能被洗脱,如TE和水;洗脱液pH值过低会降低洗脱效率,应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间,当用水洗脱时确保其pH值在此范围内;洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70水浴预热,加入洗脱液后在室温静置2-5分钟,可提高洗脱效率。
洗脱液加入位置不正确
洗脱液应加在硅胶膜中心部位,确保洗脱液能完全覆盖硅胶膜的表面以达到大洗脱效率。
洗脱体积太小
洗脱液体积若小于30μl,则不易完全浸透硅胶膜,使洗脱效率降低;洗脱液体积若超过200μl,则所得的DNA浓度会降低,但DNA总量不会减少。为了得到较高的洗脱效率可以适当增大洗脱液体积。
洗脱时间过短
洗脱时间对回收率也会有—定影响,洗脱时放置2分钟可达到较好的效果。
回收后的片断无法用于后续试验,如连接等
乙醇残留
洗脱时硅胶膜上有漂洗缓冲液残留,会使洗脱产物中含乙醇,影响下游操作,在洗脱之前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5-10分钟,彻底去除漂洗缓冲液中的乙醇。
洗出液中污染有琼脂糖
凝胶未全部溶解
洗脱产物有ssDNA,表现为在琼脂糖电泳上呈现小的弥散带。
将洗脱产物95℃加热2分钟,慢慢冷却到室温,使单链DNA重新退火复性即可。

 

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