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琼脂糖凝胶中回收基因片段

发表时间:2017-04-19  |  点击率:1007

实验原理

 

限制性内切酶切割后的DNA*片断经过电泳后,按分子量大小被分开,排列在琼脂糖凝胶中,可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来,加热或用特殊的试剂熔解凝胶,使DNA溶回到溶液中,再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的 DNA酶切片段。

 

 

实验试剂

 

1. 电泳缓冲液

2. 荧光染料

3. 电泳级琼脂糖粉

4. 10´加样缓冲液

5. DNA分子量标准(DL2000)

6. DNA凝胶回收试剂盒

 

 

实验设备

 

 

1. 旋涡混合器

2. 微量移液取样器

3. 移液器吸头

4. 1.5ml 微量离心管

5. 双面微量离心管架

6. 台式离心机

7. 琼脂糖凝胶电泳系统

8. 微波炉

9. 恒温水浴

 

 

实验步骤

 

1. 配制TAE电泳缓冲液(10´储存液),10´加样缓冲液,1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)。

2. 操作步骤

   1) 用1´TAE配制1%琼脂糖凝胶。DNA用合适的酶切。

   2) 在胶上选定两个加样孔,分别加入少量(10μl)和大量(50μl )DNA酶切产物,电泳。

   3) 电泳结束后用刀片切下含有少量DNA酶切产物的泳道(一般选择位于凝胶的边缘),在紫外灯下找到目的DNA 带,用刀片切在带的下上下边缘各切一个小口作为标记。注意:含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用加荧光染料,也不用紫外灯照射!

   4) 将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐,根据小胶条上的标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置,用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶(尽量不要多余的凝胶),转移至一个称量过的干净的1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。

   5) 按照DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明,纯化回收目的片段。

纯化/回收试剂盒组成:

溶液A:6M NaClO4,0.03M NaAc,pH5.2,少量酚红;

溶液B:3M NaAc;

溶液C:用时加入35ml无水乙醇;

溶液D:TE缓冲液。

胶回收步骤如下:

      a. 将切下的胶带放入1.5ml离心管中,按照1:3 (胶带重量:溶液A的体积)的比例加入溶液A;

      b. 50℃水溶10min,胶带完全要求完全溶化,其间可振荡助溶2~3次,待溶化后置室温加入15μl溶液B,充分混匀;

      c. 将溶液置于离心柱中,静置2min,10000rpm离心20s;

      d. 倒掉液体,加入500μl溶液C于离心柱中10000rpm离心20s,弃液体,重复该步骤一次;

      e. 12000rpm离心1min,甩干剩余液体以除去残余乙醇;

      f. 将离心柱置于新的离心管中,室温敞开离心管盖放置5~10min,使乙醇挥发殆尽;

      g. 加入20~30μl溶液D(使用前50℃水浴),静置2min;

      h. 12000rpm离心1min,管底溶液即为所需DNA,将DNA贮存于-20℃可长期保存。

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