蛋白质含量测定法

蛋白质含量测定法，是生物化学研究中常用、基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
    folin—酚试剂法早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应,而且对后者的影响还要大得多。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用. 索莱宝公司提供的Bradford 蛋白浓度测定试剂盒可以用于蛋白质含量测定，简单快速。

Bradford 蛋白浓度测定试剂盒 
货号：PC0010 
规格：2500T 
保存：开封使用后请密封保存，本试剂盒自订购之日起九个月内有效。 
产品内容： 
    组成  包装（2500微孔)  保存   
    5×G250 染色液  100ml  2-8℃   
    PBS稀释液  30ml  2-8℃   
    蛋白标准(5mg/ml BSA)  1ml  -20℃ 
产品简介： 
  考马斯亮兰G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的大吸收峰的位置（Imax），由 465nm变为 595nm，在一定的浓度范围内，测定的吸光度值 A595 与蛋白质浓度成正比。Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，样品中巯基乙醇的浓度可高达 1M，二硫苏糖醇的浓度可高达 5mM，但受略高浓度的去垢剂影响，需确保 SDS 的浓度低于 0.1%，Triton X-100 低于 0.1%，Tween 20, 60, 80 低于0.06%。含去垢剂的样品推荐使用索莱宝生产的 BCA蛋白浓度测定试剂盒。 
操作说明：操作说明： 
  一．微孔酶标仪法 
 1.  *溶解蛋白标准品，取 10ul，稀释至 250ul ，使终浓度为 0.2mg/ml。待测蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用 0.9%NaCl或 PBS 稀释标准品。 
 2. 5×G250 染色液使用前请颠倒 3-5 次混匀，取 1ml 5×G250 染色液，加入 4ml 双蒸水，混匀成 1×G250染色液，此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。 
 3.  将标准品按 0,2,4,6,8,12,16,20 微升分别加到 96 孔板中，加 PBS 稀释液补足到 20 微升。 
 4.  将样品作适当稀释（好多做几个梯度，如作2 倍、4 倍、8 倍稀释），加 20 微升到96 孔板的样品孔
中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线1/2 后。  
 5.  各孔加入 200 微升稀释后的 1×G250染色液，室温放置 3-5 分钟。 
 6.  用酶标仪测定 A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。 
 7.  根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。 
 二．分光光度计法 
  如无酶标仪，染色反应可在离心管中进行，反应液混匀后加入比色皿中，使用分光光度计测定吸光值。 
步骤如下： 
   1.  取八支（或者更多）干净的 10ml 离心管，标记上号。 
   2.  取 100ulBSA加入 PBS 2.4ml 稀释至终浓度为 0.2mg/ml。 
  3.  5×G250 染色液使用前请颠倒 3-5 次混匀，取 10ml 5×G250 染色液，加入 40ml 双蒸水，混匀成 1×G250 染色液，此 1×G250 染色液可在 4℃保存一周。 
4.  按下表加入试剂(以每孔 5ml 计，多余的用来清洗比色皿) 
离心管号  1  2  3  4  5  6  7（样品管 1） 8（样品管 2）   9（样品管 3）
标准蛋白 BSA  0ul  100ul  200ul  300ul 400ul 500ul 500ul 适当稀
释的样品 1 
500ul 适当稀
释的样品 2 
…… 
PBS  500ul  400ul  300ul  200ul 100ul 0ul  0ul  0ul   0ul 
1XG250 染色液  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml  5ml 
5.  反应 3 分钟后测 OD 值。为了实验的准确性，可每间隔 2 分钟加一管染色液，每间隔 2 分钟测一管 OD
值。如下表： 
离心管号  1  2  3  4  5  6  7  8  …… 
加染色液（分钟）  0  2  4  6  8  10  12  14  …… 
测 OD值  3  5  7  9  11  13  15  17  …… 
考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。