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辅酶ⅠNAD(H)含量测试盒 常量可见分光光度法 说明 技术 文章
点击次数:356 发布时间:2019-03-29
  • 前位置: 首页 > 生理生化试剂盒 > 常量分光光度计法 > 辅酶I系列 > 辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒

product-view

辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒

商品货号:QS1000
英文名称:NAD(H) Kit
别名:辅酶Ⅰ含量测定试剂盒 NAD(H) Kit 辅酶ⅠNAD(H)含量测定试剂盒 辅酶ⅠNAD(H)含量测试盒
检测方法:常量法

 

商品货号:商品品牌:规格基本售价选择规格
QS1000-50管/24样 50管/24样¥500.00元 

 

  • 产品详细介绍
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  • 产品说明书

 

测定意义:

辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循环(TCA)的主要氢受体,生成的NADH经呼吸电子链(ETC)传递把电子交给氧,在合成ATP的同时,形成大量的ROS,同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外,NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理:

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH,NADH通过PMS的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒,在570nm下检测吸光值;而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH,进一步采用MTT还原法检测。

货号:QS1000                                                      规格:50管/24样                                     

辅酶ⅠNAD(H)含量试剂盒说明书

可见分光光度法

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循环(TCA)的主要氢受体,生成的NADH经呼吸电子链(ETC)传递把电子交给氧,在合成ATP的同时,形成大量的ROS,同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外,NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH,NADH通过PMS的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒,在570nm下检测吸光值;而NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH,进一步采用MTT还原法检测。

自备的实验用品及仪器:

可见分光光度计、台式离心机、移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

酸性提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;

碱性提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体15 mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:液体4 mL×1瓶,4℃保存;

试剂三:粉剂×1瓶,-20 ℃避光保存,用时加入4mL蒸馏水,混匀,用不完的试剂4℃

        保存一周;  

试剂四:粉剂×1瓶,4 ℃避光保存,用时加入4mL蒸馏水,混匀,用不完的试剂4℃保

        存一周;

试剂五:液体1.8mL×1支,4 ℃保存;

试剂六:液体30mL×1瓶,4 ℃保存;

试剂七:液体50mL×1瓶,4 ℃保存。

NAD+和NADH的提取

1 血清(浆)中NAD+和NADH的提取

NAD+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议取约0.1mL血清(浆),加入1mL酸性提取液),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

NADH的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议取约0.1mL血清(浆),加入1mL碱性提取液),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2组织中NAD+和NADH的提取:

NAD+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议取约0.1g组织,加入1mL酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

NADH的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议取约0.1g组织,加入1mL碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

3 细胞或细菌中NAD+和NADH的提取:

NAD+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):酸性提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

NADH的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):碱性提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),95℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取500μL上清液,加入500μL酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

  1. 分光光度计预热30min以上,调节波长至570nm,蒸馏水调零。
  2. 加样表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样):

试剂名称(μL)

对照管

测定管

样本

50

50

试剂一

250

250

试剂二

75

75

试剂三

75

75

试剂四

75

75

试剂五

35

35

试剂六

500

混匀,室温避光静置20min

试剂六

 

500

充分混匀,静置5min后,20000g,25℃离心5min,弃上清,沉淀中加入:

试剂七

1000

1000

混匀,570nm下比色,读取对照吸光值A1和测定管吸光值A2,计算△A=A2-A1。

注意事项

1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应20min后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒50管保证测24个NAD+或NADH.。

NAD+和NADH含量的计算

(一)NAD+含量的计算

1、血清(浆)中NAD+含量计算

NAD+含量(nmol/mL)=[ (△A -0.099)×36.1×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 722×(△A -0.099)

2、组织、细菌或细胞中NAD+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NAD+ (nmol/mg prot)=[ (△A -0.099)×36.1×V1)]÷(V1×Cpr)= 36.1×(△A -0.099)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NAD+ (nmol/g 鲜重)= [ (△A -0.099)×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2)= 72.2×(△A -0.099)÷W

 (3)按细菌或细胞密度计算

NAD+ (nmol/104 cell)=[ (△A -0.099)×36.1×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.1444×(△A -0.099)

(二)NADH含量的计算

1、血清(浆)中NADH含量计算

NADH含量(nmol/mL)= [ (△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 494×(△A -0.065)

2、组织、细菌或细胞中NADH含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADH (nmol/mg prot)= [ (△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(V1×Cpr)= 24.7×(△A -0.065)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADH (nmol/g 鲜重)= [ (△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 49.4×(△A -0.065)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADH (nmol/104 cell)= [ (△A -0.065)×24.7×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0988×(△A -0.065)

V1:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

注意:低检测限为1nmol/mL或1nmol/g鲜重 或0.01nmol/mg prot

辅酶Ⅰ系列    
QS1000辅酶ⅠNAD(H)含量测试盒可见分光光度法50管/24样500
MS1000辅酶ⅠNAD(H)含量测试盒微量法100管/48样920
QS1001乳酸脱氢酶(LDH)测试盒可见分光光度法50管/24样170
MS1001乳酸脱氢酶(LDH)测试盒微量法100管/48样330
QS1002NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)测试盒紫外分光光度法50管/48样280
MS1002NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)测试盒微量法100管/96样550
QS1003NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测试盒紫外分光光度法50管/48样320
MS1003NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测试盒微量法100管/96样600
QS1004NADH氧化酶(NOX)测试盒  可见分光光度法50管/48样450
MS1004NADH氧化酶(NOX)测试盒  微量法100管/96样850
QS1005-50柠檬酸合酶(CS)测试盒可见分光光度法50管/48样3200
QS1005-25柠檬酸合酶(CS)测试盒可见分光光度法25管/24样2000
MS1005柠檬酸合酶(CS)测试盒微量法100管/48样3500
QS1006丙酮酸脱羧酶(PDC)测试盒紫外分光光度法50管/48样720
MS1006丙酮酸脱羧酶(PDC)测试盒微量法100管/96样1400
QS1007醇脱氢酶(ADH)测试盒紫外分光光度法50管/48样280
MS1007醇脱氢酶(ADH)测试盒微量法100管/96样550
QS1008单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)测试盒紫外分光光度法50管/48样800
MS1008单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)测试盒微量法100管/96样1550
QS1009乙醛脱氢酶(ALDH)测试盒紫外分光光度法50管/48样420
MS1009乙醛脱氢酶(ALDH)测试盒微量法100管/96样800
QS1010NAD激酶(NADK)测试盒可见分光光度法50管/48样600
MS1010NAD激酶(NADK)测试盒微量法100管/48样1100
QS1011线粒体呼吸链复合体Ⅰ/NADH-辅酶Q还原酶测试盒   紫外分光光度法25管/24样1280
MS1011线粒体呼吸链复合体Ⅰ/NADH-辅酶Q还原酶测试盒   微量法100管/96样2500
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