超氧化物检测试剂盒

规格：100次

Ø 超氧化物检测试剂盒（Superoxide Assay Kit）是一种用于超氧化物快速高灵敏度检测的试剂盒。

Ø 本试剂盒利用超氧化物可以还原WST-1产生可溶性有色物质为基础来检测超氧化物。本试剂盒的检测试剂中添加了Catalase（触酶）等，可以清除过氧化氢等过氧化物对WST-1显色的干扰，使测定结果更加准确。并且本试剂盒还提供SOD（超氧化物歧化酶），可以验证本试剂盒测定出的结果是否为超氧化物，以排除检测体系中所用的一些试剂可能产生的干扰。对于本试剂盒，加入SOD后通常可以抑制90％以上的超氧化物。 

Ø WST-1是一种类似于MTT的化合物，可以被超氧化物还原生成橙色的formazan。超氧化物产生越多越快，则颜色越深，即相应测定得到的吸光度值越大。   

Ø 使用WST-1作为检测试剂比用传统的细胞色素c（cytochrome c）检测超氧化物具有多方面的优点。首先，WST-1本身的吸光度非常低（通常OD450为0.02左右，因仪器和酶标板不同而有所不同），而细胞色素c本身的吸光度非常高（通常OD550为0.5左右），因此，使用WST-1与细胞色素c相比，检测灵敏度高很多倍。其次，WST-1的还原产物是稳定的可溶性产物，且对细胞基本无毒性，使WST-1方法更加适合于高通量的筛选。另外，细胞色素c法由于灵敏度的限制，一般不适合用96孔板测定，而WST-1法可以用96孔板测定，使检测更加便捷。用WST-1法或细胞色素c法对超氧化物测定效果比较参考图1。图1中，50万/毫升嗜中性粒细胞在37℃用PMA刺激时间，用WST-1或细胞色素c方法分别测定。WST-1法测定OD450，而细胞色素c法测定OD550。另外，WST-1法和luminol法相比，灵敏度相近，但仅须使用普通的酶标仪，无须使用luminol法所需的luminometer，并且检测速度也比luminol 图1. WST-1法和细胞色素c法对于法更加快捷。 超氧化物测定效果的比较。

Ø 超氧化物通常指超氧化物阴离子（superoxide anion）O2·-，是一种氧分子的自由基。在呼吸链中，NADPH氧化酶把电子传递给氧分子的时候，就会产生超氧化物阴离子）O2·-。 超氧化物阴离子）O2·-是一种强氧化剂，可以由被刺激的白细胞等产生，从而抵御微生物的感染等。超氧化物阴离子）O2·-也可以导致氧化损伤，和许多疾病的发生密切相关。

Ø 本试剂盒可以测定100个样品。

产品编号  产品名称            包装

S0060-1  超氧化物检测缓冲液 30 ml 

S0060-2   WST-1溶液         1 ml 

S0060-3   Catalase溶液        200微升 

S0060-4   SOD溶液           20微升 

— 说明书 1份

-20℃保存，一年有效。

Ø WST-1溶液、Catalase溶液和SOD溶液均宜尽量避免反复冻融，可以适当分装。

Ø 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

1. 超氧化物检测工作液的配制：

按照下表比例配制超氧化物检测工作液：

1个检测   5个检测 10个检测  20个检测   50个检测 

超氧化物检测缓冲液 200微升    1毫升    2毫升      4毫升   10毫升 

WST-1溶液          10微升   50微升  100微升    200微升 500微升 

Catalase溶液        2微升    10微升  20微升    40微升 100微升 

超氧化物检测工作液 212微升 1.06毫升   2.12毫升  4.24毫升 10.6毫升 

2. 悬浮细胞产生超氧化物的检测：

a. 细胞用PBS、Hanks液或生理盐水洗涤一次。 

b. 约按5-10万个细胞/毫升的比例，用超氧化物检测工作液悬浮细胞。

c. 在96孔板中，每孔加入200微升用超氧化物检测工作液悬浮的细胞，每孔约1-2个细胞。

d. 37℃孵育3分钟。

e. 在预定的检测孔中加入预计可以诱导产生超氧化物的刺激物，如PMA等，刺激10-60分钟或其它预定的时间。须至少留一个不加刺激物的孔作为空白对照。选择1-2个加刺激物的孔中加入2微升SOD以验证整个检测体系，加SOD溶液的检测可以不做。试剂盒提供的SOD溶液足够做10个检测。具体检测时的安排参考下表： 

细胞 超氧化物检测工作液 刺激物 SOD溶液 

空白对照 ＋              ＋         －        － 

待测样品 ＋              ＋         ＋        － 

阴性对照 ＋              ＋         ＋        ＋ 

f. 在450nm测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长作为参考波长进行双波长测定。

3. 贴壁细胞产生超氧化物的检测：

a. 约按每孔5000-10000个细胞（具体的细胞接种数量须根据细胞的大小和生长速度自行确定）把细胞培养到96孔板中，使第二天或待检测时细胞为80-90%满。 

b. 吸去培养液，用PBS、Hanks液或生理盐水洗涤一次。

c. 每孔加入200微升超氧化物检测工作液，37℃孵育3分钟。

d. 在预定的检测孔中加入预计可以诱导产生超氧化物的刺激物，如PMA等，刺激10-60分钟或其它预定的时间。须至少留一个不加刺激物的孔作为空白对照。选择1-2个加刺激物的孔中加入2微升SOD以验证整个检测体系，加SOD溶液的检测可以不做。试剂盒提供的SOD溶液足够做10个检测。具体检测时的安排参考下表： 

细胞 超氧化物检测工作液 刺激物 SOD溶液

空白对照 ＋          ＋           －        －

待测样品 ＋          ＋           ＋         －

阴性对照 ＋          ＋           ＋         ＋ 

e. 在450nm测定吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长作为参考波长进行双波长测定。