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活性氧检测试剂盒

发表时间:2010-01-04  |  点击率:3784

                                                       活性氧检测试剂盒

一.产品简介:
       活性氧检测试剂盒(Reactive oxygen species assay kit)是一种利用荧光探针 DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-
       DA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而 DCFH不能通透细胞膜,从而使
       探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧
       的水平。
       本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物(compound mixture),浓度为50mg/ml。
       本试剂盒本底低,灵敏度高,线性范围宽,使用方便。
       本试剂盒可以测定100-500个样品。
二.包装清单:
       DCFH-DA 10mM    0.1 ml
活性氧阳性对照(Rosup, 50mg/ml)       1 ml
说明书     1
三.保存条件:-20℃保存,一年有效。
四.注意事项:
探针装载后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。
探针装载完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的装载情况是否良好。
尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外),以减少各种可能的误差。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
五.使用说明:
1.    装载探针
       对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞,先装载探针,后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激
       时间较长(通常为6小时以上)的细胞,先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞,后装载探针。
       原位装载探针:本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使终浓度为10微摩尔/升。去除细
       胞培养液,加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜,通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-
       DA的体积为1毫升。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
       通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
       收集细胞后装载探针:按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的
       DCFH-DA中,细胞浓度为一百万至二千万/毫升,37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下,使探针和细胞充分
       接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺
       激细胞,或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
2.    检测
       对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察,或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
       对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测,用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
3.    参数设置
       使用488nm激发波长,525nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似,可以用
       FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。
4.    其它说明
       阳性对照可以按照1:1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升,可以加入1微升的阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟
       内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞,活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内
       观察不到活性氧的升高,可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快,可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
       另外,对于某些细胞,如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强,可以按照1:2000-1:5000稀释DCFH-DA,使装载探针时
       DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
六.使用本产品的文献:
1. Jia SJ, Jiang DJ, Hu CP, Zhang XH, Deng HW, Li YJ.
Lysophosphatidylcholine-induced elevation of asymmetric dimethylarginine level by the NADPH oxidase pathway in endothelial cells.
Vascul Pharmacol. 2005 Nov 22; [Epub ahead of print] (Impact factor:2.547)

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