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γ -谷氨酰半胱氨酸连接酶试剂盒说明书

发表时间:2013-04-15  |  点击率:2989

                    

γ -谷氨酰半胱氨酸连接酶(glutamate cysteine ligaseGCL

试剂盒说明书(50T

                                         

一、 测定意义

GCL 是由催化亚基 GCLC 和调节亚基 GCLM 组成异二聚体。GCL  GSH  合成的限

速酶,GSH  GCL  有反馈抑制作用。GCL  作为 GSH  合成的限速酶,其本身或者其亚单

GCLCGCLM  的表达均可被多种因素调节,如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因

子等。

二、 测定原理

在谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、ATP Mg

2+存在下,GCL 催化三种氨基酸合成 GSH

同时 ATP 去磷酸化产生无机磷分子,通过测定无机磷毫摩尔数,即可计算出 GCL 活性。

三、 实验中所需仪器及设备

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、1ml 比色皿、双蒸水

四、 试剂组成和配置

试剂一×1 支,液体一×1 支;临用前,液体一加入试剂一后加双蒸水至 60ml,如未用

4℃保存,可用一周

试剂二×1 支,临用前加 16ml 双蒸水充分溶解

试剂三×1 支,液体二×1 支;临用前,先加约 30ml 双蒸水充分溶解试剂三后,缓慢

加入液体二,边加边搅拌,加完液体二后继续加双蒸水至 50ml

试剂四×1 支,溶于 3.5ml 双蒸水中,4℃保存

试剂五×1 支,临用前加双蒸水 20ml,置于冰上

        标准磷溶液×1 支(浓度为 400μg/ml

五、 样品前处理

称约 0.1g 组织,加入 1ml 试剂一(生理盐水),冰上充分研磨,10000rpm 4℃离心 10min

取上清如上清不清澈,再离心 3min)

六、 GCL 测定操作

按下表操作

测定管 空白管

试剂一 0.24ml 0.36ml

试剂二 0.26ml 0.26ml

0.12ml

试剂四 0.06ml 0.06ml

试剂五 0.3ml 0.3ml

试剂三 0.5ml 0.5ml

37 水浴15mim

5000g离心10min 取上清0.5ml

45 水浴10min

冷却后,取 1ml 上清液于 660nm处测定其吸光值,请于水浴后 1040 分钟内侧完。

      

七、 标准曲线:

40μg/ml 的磷标准溶液,用双蒸水稀释成 20μg/ml10μg/ml5μg/ml2.5μg/ml

1.25μg/ml0μg/ml 的磷溶液,分别取不同浓度磷溶液 0.5ml 与试剂三 0.5ml 混合后,45

水浴 10min,待冷却后取 1ml 660nm 处测定其吸光值,制作标准曲线,得标准曲线公

式为:y=0.143x-0.0035x 为磷浓度,y 为吸光值,R

2

=1试剂中有标准磷溶液,可自

己重做标准曲线,需先稀释 20 倍,然后配成不同浓度

八、 GCL 活力计算

a) GCL 活力单位定义:37℃下,每毫克蛋白每分钟催化产生 1mmol 无机磷的 GCL

酶活量为 1U

b) GCL 活力计算:(OD 测定管-OD 空白管)/15,代入标准曲线 y=0.1284x+0.1177x

为磷浓度,y 为吸光值),即可算得无机磷毫摩尔数记为 np

GCLU/mg=np×V /V 样÷Cpr

                        =np×15.5÷Cpr

V 总:反应总体积(ml

V 样:所用样品体积(ml

Cpr:蛋白浓度(mg/ml

注意事项

1 样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,以免影响其活力,如果是

匀浆液,避免反复冻融

2 所有试剂配制完后,除表明 4℃保存外,请于 1 天内用完

3 实验过程请带手套,试剂三中有强腐蚀性物质,注意不要溅到皮肤上或眼睛内

4 测定吸光值时请于水浴后 1040 分钟内测完

5 样本测定前先取 1-2 个样做预实验,如吸光值太高,应先用试剂一生理盐水稀释到适

当倍数,使得吸光值在标准曲线范围内,哺乳动物组织和血液一般稀释 35

6 试剂三配制过程中,可能会产生黑色固体,其不影响结果,注意吸取时不要将黑色固体

吸入

           

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