质粒提取试剂盒简介

质粒提取试剂盒简介：
质粒（Plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不
等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞
中。质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制
和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的
遗传信息。
质粒提取原理及流程：
较常用的质粒DNA提取方法有3种：碱裂解法、煮沸法和去污剂
（如Triton和SDS）裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒
（<15kb）。去污剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质粒（>15kb）。
碱裂解法是一种应用为广泛的制备质粒DNA的方法，其原理
为：染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分
子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，
线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性
时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞
碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态
存在液相中，离心去除沉淀后，就可从上清中回收质粒DNA。
目前，市面上质粒提取试剂盒大多数都是采取上述的碱裂解方法，
不同之处在于纯化方式。目前比较常用的纯化系统是硅基质吸附材
料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，然后用
低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以
用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。
影响质粒提取的因素：
质粒提取的得率和质量与很多因素有关，如宿主菌的种类和培养
条件、细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附
柱的吸附量等。
宿主菌种类
质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，多数情况下我们是
从大肠杆菌中提取质粒。大肠杆菌的菌株不同会影响质粒提取的
质量。从宿主菌如DH5α和*0中可以得到高质量的质粒DNA。
HBl01和它的衍生菌株，如TG1和JM系列会在裂解时产生大量的糖
类，如果没有*去除，将抑制后续实验中的酶活性，影响质粒
DNA提取的质量。另外，有些菌株有非常高的内切酶活性，会降低
DNA的得率。因此推荐使用DH5α和*0来提取质粒DNA。
培养时间
从固体培养基平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中（含有相关抗生
素的液体培养基中），振荡培养12-16小时。不应超过16小时，因为这时
细胞开始裂解，使得质粒的得率降低，也会导致质粒丢失或质粒变异。
质粒扩增
氯霉素能抑制宿主细胞蛋白质和DNA的合成，但对松弛型质粒的
复制没有影响。因此，在细菌培养液中加入氯霉素可提高松弛型质
粒的拷贝数。由于氯霉素抑制了宿主细胞蛋白质和DNA的合成，
从而抑制了染色体的复制，但质粒复制所用的酶半衰期较长，故质
粒仍可继续复制，这样既可增加质粒产量，又可降低细胞的数量，
使细菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于扩增的氯霉素浓度为
170ug/ml 。
抗生素
在菌株的各生长阶段都应加入抗生素筛选。现在用的许多质粒都不
含有在细胞分裂时确保平均分配的par位点，无质粒的子细胞在无
抗生素时复制速度远大于含质粒的细胞。

质粒拷贝数:
质粒拷贝数常用的定义是指生长在标准的培养基下每个细菌细胞中
所含有的质粒DNA分子的数目。每个细胞中的质粒数主要决定于质
粒本身的起始复制机制。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一
类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每
个细胞内只有1-2个质粒，如F因子；另一类是松弛型质粒，当染
色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质
粒，如ColEl质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型，分子量较小的
质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒
在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
部分质粒的拷贝数
质粒种类 拷贝数 起始复制子 类型
pUC18/19载体 500-700 pMB1 高拷贝
pBluescript载体 300-500 ColE1 高拷贝
pGEM-T载体 300-400 pMB1 高拷贝
pTZ载体 >1000 pMB1 高拷贝
pBR322载体 15-20 pMB1 低拷贝
pACYC及其衍生载体 10-122 p1 低拷贝
pSC101及其衍生载体 5 pSC101 低拷贝
菌液收集及裂解
细菌收集可以通过离心来进行，不同的质粒拷贝数，菌液量的需
求不同，对于低拷贝的质粒，要相应增加菌液的量。菌液是在碱
性环境下裂解的，由于不同的宿主菌细胞壁厚薄的差异，细胞的
破壁程度不同，对于细胞壁较厚的宿主菌，首先要进行破壁处理：
革兰氏阴性菌——不用特殊处理，碱裂解时就能有效破壁
革兰氏阳性菌——溶菌酶处理
酵母和丝状真菌——酵母破壁酶或玻璃珠
菌液收集、重悬以及宿主菌细胞破壁后，细胞在含有RNase A的
NaOH/SDS（溶液Ⅱ）中裂解。SDS溶解细胞膜的磷脂和蛋白成分，使
细胞的内容物如染色体、质粒DNA和蛋白在碱性环境下变性。佳的
裂解时间是质粒大量释放而没有释放染色体DNA的时间，尽量缩短
质粒暴露在变性环境中。长时间处在碱性环境中会导致质粒发生不可
恢复的变性。变性的质粒在琼脂糖胶上跑的较快，而且不能被限制性
内切酶消化。裂解产物在溶液Ⅲ中被调整到中性高盐环境，高盐使得
变性的蛋白、染色体DNA、细胞碎片和SDS都沉淀下来，而质粒复性
留在上清溶液中。溶液要*混匀以确保沉淀*。为了防止染色体
DNA污染质粒DNA，要避免剧烈振荡，以防止染色体DNA被打断，造
成对质粒DNA的污染。因为染色体DNA的片段和质粒DNA在高盐条件
下，都可以与硅胶膜结合，在低盐的条件下，用洗脱液都能从膜上洗
脱下来。因此，在裂解过程中要缓慢、轻柔颠倒离心管。
质粒DNA分离和纯化：
纯化要求
质粒DNA中不应存在对后续实验中的酶活性有抑制作用的有机溶
剂分子或过高浓度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多
糖、脂类、基因组和RNA的污染。不同的后续实验对于质粒纯度的
要求不同，常规的分子生物学实验（如酶切、测序等）普通纯度的质粒
即可满足实验，而对于转染实验，要求质粒的纯度较高（如高纯度或无
内毒素）。可以选择不同的质粒提取试剂盒以满足不同的实验要求。
纯化方法
用硅基质材料吸附质粒DNA来代替乙醇沉淀的纯化方式，提取的质
粒纯度高、操作方便快捷，可选择的试剂盒有两种类型，即普通质
粒提取试剂盒和无内毒素质粒提取试剂盒。
质粒DNA的洗脱和收集
质粒的保存
溶解在洗脱液TE中的质粒DNA，也可以贮存在TE缓冲液中（用水溶
解的质粒只能短期保存，因为实验室用的纯水呈弱酸性，质粒在
酸性环境下会发生磷酸解），4℃短期保存或-20℃和-70℃长期保
存，也可在含有质粒的细菌培养物中，加等体积甘油，于-70℃保
存 。
质粒鉴定与评价：
琼脂糖电泳检测
碱裂解法提取的质粒经琼脂糖电泳进行鉴定时，理想状况是只出现
超螺旋—条带，但在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂
等原因，使质粒DNA链发生断裂，可能出现两条带或者出现三条
带，这三条带电泳迁移率从快到慢，分别是超螺旋、开环和复制中
间体（即没有复制*的两个质粒粘连在—起）。如果加溶液Ⅱ后过
度振荡，会在远离这三条带的位置出现条带，这条带泳动得较慢，
是大肠杆菌基因组DNA的片断。非常偶然的是，有时候提取的质粒
会出现4个以上的条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度
的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。但是，只要质粒经单酶切鉴定
后，只有单一条带，就证明没有基因组的污染。
酶切检测
质粒提取后，为了进—步鉴定质粒的正确与否，就要进行酶切鉴
定，通过与Marker对比，确定质粒的分子量大小。
用紫外线分光光度计检测
浓度测定标准为：OD260值为1相当于大约50ug/ml双链DNA。OD260/
OD280比值在1.7-1.9之间说明所得DNA纯度较好。OD260/OD280比值
若低于1.7说明可能有蛋白污染。OD260/OD280比值若高于2.0则说明
DNA有可能已降解。如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子
水，比值会偏低，因为pH值和离子浓度会影响光吸收值，但并不表
示纯度低。