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质粒DNA分离和纯化

发表时间:2010-03-08  |  点击率:3568

质粒DNA分离和纯化:
纯化要求
质粒DNA中不应存在对后续实验中的酶活性有抑制作用的有机溶
剂分子或过高浓度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多
糖、脂类、基因组和RNA的污染。不同的后续实验对于质粒纯度的
要求不同,常规的分子生物学实验(如酶切、测序等)普通纯度的质粒
即可满足实验,而对于转染实验,要求质粒的纯度较高(如高纯度或无
内毒素)。可以选择不同的质粒提取试剂盒以满足不同的实验要求。
纯化方法
用硅基质材料吸附质粒DNA来代替乙醇沉淀的纯化方式,提取的质
粒纯度高、操作方便快捷,可选择的试剂盒有两种类型,即普通质
粒提取试剂盒和无内毒素质粒提取试剂盒。
质粒DNA的洗脱和收集
参见基因组DNA提取
质粒的保存
溶解在洗脱液TE中的质粒DNA,也可以贮存在TE缓冲液中(用水溶
解的质粒只能短期保存,因为实验室用的纯水呈弱酸性,质粒在
酸性环境下会发生磷酸解),4℃短期保存或-20℃和-70℃长期保
存,也可在含有质粒的细菌培养物中,加等体积甘油,于-70℃保
存 。
质粒鉴定与评价:
琼脂糖电泳检测
碱裂解法提取的质粒经琼脂糖电泳进行鉴定时,理想状况是只出现
超螺旋—条带,但在质粒提取过程中,由于机械力、酸碱度、试剂
等原因,使质粒DNA链发生断裂,可能出现两条带或者出现三条
带,这三条带电泳迁移率从快到慢,分别是超螺旋、开环和复制中
间体(即没有复制完全的两个质粒粘连在—起)。如果加溶液Ⅱ后过
度振荡,会在远离这三条带的位置出现条带,这条带泳动得较慢,
是大肠杆菌基因组DNA的片断。非常偶然的是,有时候提取的质粒
会出现4个以上的条带,这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度
的超螺旋(超螺旋的圈数不同)所致。但是,只要质粒经单酶切鉴定
后,只有单一条带,就证明没有基因组的污染。
酶切检测
质粒提取后,为了进—步鉴定质粒的正确与否,就要进行酶切鉴
定,通过与Marker对比,确定质粒的分子量大小。
用紫外线分光光度计检测
浓度测定标准为:OD260值为1相当于大约50ug/ml双链DNA。OD260/
OD280比值在1.7-1.9之间说明所得DNA纯度较好。OD260/OD280比值
若低于1.7说明可能有蛋白污染。OD260/OD280比值若高于2.0则说明
DNA有可能已降解。如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子
水,比值会偏低,因为pH值和离子浓度会影响光吸收值,但并不表
示纯度低。

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