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影响质粒提取的因素

发表时间:2010-03-08  |  点击率:4536

影响质粒提取的因素:
质粒提取的得率和质量与很多因素有关,如宿主菌的种类和培养
条件、细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附
柱的吸附量等。

宿主菌种类
质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中,多数情况下我们是
从大肠杆菌中提取质粒。大肠杆菌的菌株不同会影响质粒提取的
质量。从宿主菌如DH5α和*0中可以得到高质量的质粒DNA。
HBl01和它的衍生菌株,如TG1和JM系列会在裂解时产生大量的糖
类,如果没有完全去除,将抑制后续实验中的酶活性,影响质粒
DNA提取的质量。另外,有些菌株有非常高的内切酶活性,会降低
DNA的得率。因此推荐使用DH5α和*0来提取质粒DNA。
培养时间
从固体培养基平板上挑取一个单菌落,接种到培养物中(含有相关抗生
素的液体培养基中),振荡培养12-16小时。不应超过16小时,因为这时
细胞开始裂解,使得质粒的得率降低,也会导致质粒丢失或质粒变异。
质粒扩增
氯霉素能抑制宿主细胞蛋白质和DNA的合成,但对松弛型质粒的
复制没有影响。因此,在细菌培养液中加入氯霉素可提高松弛型质
粒的拷贝数。由于氯霉素抑制了宿主细胞蛋白质和DNA的合成,
从而抑制了染色体的复制,但质粒复制所用的酶半衰期较长,故质
粒仍可继续复制,这样既可增加质粒产量,又可降低细胞的数量,
使细菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于扩增的氯霉素浓度为
170ug/ml 。
抗生素
在菌株的各生长阶段都应加入抗生素筛选。现在用的许多质粒都不
含有在细胞分裂时确保平均分配的par位点,无质粒的子细胞在无
抗生素时复制速度远大于含质粒的细胞。

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