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培养细胞染色体显示法

发表时间:2016-03-16  |  点击率:666

1、植物组织蛋白质提取方法
1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液,可根据材料不同适当加入),准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。
3、用离心机离心8000rpm40min411100rpm20min4
4、提取上清夜,样品制备完成。
蛋白质提取液:300ml
1
1Mtris-HClPH8 45ml
2
、甘油(Glycerol75ml
3
、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone6g
这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳!

2、植物组织蛋白质提取方法 
三氯醋酸丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨叶片
2、加入样品体积3倍的提取液在-20的条件下保存12小时,然后离心(48000rpm以上1小时)弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%β-巯基乙醇),摇匀后离心(48000rpm以上1小时),然后真空干燥沉淀,备用。
4、上样前加入裂解液,室温放置30分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(158000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4待用。
5、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80备用。
药品:
提取液:含10%TCA0.07%β-巯基乙醇的丙酮
裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1MDTT65ul/ml
这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少!

3、组织:肠黏膜 
目的:WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达
应用TRIPURE提取蛋白质步骤:
含蛋白质上清液中加入异丙醇:(1.5ml1mlTRIPURE用量)
倒转混匀,置室温10min
离心:12000 g10min4度,弃上清
加入0.3M盐酸胍/95%乙醇:(2ml1mlTRIPURE用量)
振荡,置室温20min
离心: 7500g5 min4度,弃上清
重复0.3M盐酸胍/95%乙醇步2
沉淀中加入100%乙醇 2ml
充分振荡混匀,置室温20 min
离心: 7500g5min4度,弃上清吹干沉淀
1SDS溶解沉淀
离心:10000g10min4
取上清-20度保存(或可直接用于WESTERN BLOT
存在的问题:加入1SDS后沉淀不溶解,还是很大的一块,4度离心后又多了白色沉定,SDS结晶?测浓度,含量才1mg/ml左右。
解决:提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮510分钟,效果很好的。

4、植物材料:水稻苗,叶鞘,根
1200毫克样品置于冰上磨碎
2、加lysis buffer,离心,10000rpm4度,5min取上清
3、重复离心5min
lysis buffer
urea   np-40  ampholine 2-me  pvp-40

5、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% Trichloroacetic acid(丙酮配制,含10mM0.07%β-巯基乙醇),混匀,-20沉淀1小时,415000 r/min离心15 min,弃上清,沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(10 mMβ-巯基乙醇),再于-20沉淀1小时,同上离心弃上清,(有必要再用80%丙酮(10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20μl(可调) UKS[9.5 M尿素,5mM碳酸钾,1.25%SDS0.5%DTT(二硫苏糖醇)2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech IncpH3.5-10)6% Triton X-100]37温育30min,期间搅动几次,28 (温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min离心15 min,离心力越大时间长一点越好!上清即可上样电泳。或者-70度保存

6、植物根中蛋白质的抽取
(1) sample, 液氮研磨
(2) 1.5 ml centrifuge tube
(3)
1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm, 4
, 10-15minite
(5)
取上层液,蛋白质就在里面 

 

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