使用土壤硝酸还原酶测试盒测定的意义及操作方法

　　S-NR催化土壤中硝酸盐还原为亚硝酸盐，是土壤硝态氮还原的关键酶。研究S-NR的活性对合理施肥，降低氮素的损失具有重要意义。
 

　　测定原理
 

　　S-NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ+NADH+H+→NO2ˉ+NAD++H2O;产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成红色偶氮化合物;生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
 

　　土壤硝酸还原酶测试盒的操作步骤:
 

　　实验开始前，各试剂均应平衡至室温(试剂不能直接在37℃溶解);试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
 

　　1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
 

　　2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl(在使用前一小时内配制)，酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。
 

　　3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
 

　　4.每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液)100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。
 

　　5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。
 

　　6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色(30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。
 

　　7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。