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免疫佐剂及研究进展

发表时间:2013-01-31  |  点击率:1625

 免疫佐剂及研究进展

佐剂(免疫增强剂或免疫调节剂)在免疫中的作用主要是提升机体免疫系统(体液或细胞免疫系统)对抗原或免疫原的免疫应答反应,包括增强免疫反应强度和反应的持久性。随着人们对各种病原的抗原成分及免疫机理的深入了解和越来越多的亚单位疫苗成分被纳入免疫学研究过程,对佐剂的研究和应用将会越来越深入和广泛。佐剂的作用原理主要包括三个方面,一是激活先天性免疫应答反应,如弗氏佐剂、免疫刺激复合物和CpG佐剂等。二是提高抗原对免疫系统的提呈和刺激作用,如脂质体类佐剂和免疫刺激复合物(ISCOM)。三是延长抗原(免疫原)在机体内的存在时间和保持对免疫系统的持续激活作用。很多佐剂中的矿物油成分主要是起到缓释作用。除了弗氏佐剂兼具这三种特性以外,大多数佐剂在功能上都存在一定的缺陷。根据来源不同,佐剂分为化学合成类佐剂和生物成分类佐剂。很多病原生物的组成成分本身就是天然的佐剂,如弗氏完全佐剂中的结核杆菌,乙肝病毒表面膜蛋白及细菌的LPS和CpG序列等。传统的佐剂多与抗原混合成乳胶(Emulsion)的形式注射使用。乳胶有“油包水”和“水包油” 两种形式。前者有利于延长抗原在体内的存在时间和提高抗原的免疫原性,但对局部组织具有很强的刺激反应。后者有利于抗原的快速吸收,副作用小,但免疫反应可能弱且持续的时间短。
对佐剂的研究是疫苗研究过程中的重要组成部分。目前除了弗氏佐剂以外还没有任何一种佐剂能够对体液和细胞免疫系统同时发挥很有效的免疫激活作用。但弗氏佐剂能够引起注射部位组织的损伤和长时间的痛苦,因而只能用于对抗原的初期免疫应答研究及免疫血清或抗体的制备,不适合作为疫苗的组成成分使用。此外,在疫苗制备过程中选择哪一种佐剂还主要取决于所要获得的保护性免疫应答反应。有些佐剂以激发体液免疫应答反应为主,也有些佐剂则对细胞免疫应答反应具有很强的激活作用。

1 铝盐佐剂
铝盐(氢氧化铝和磷酸铝)佐剂是*个被批准可用于人的佐剂。其主要功能为缓释,但同时具有对免疫细胞的激活作用。将蛋白质和氢氧化铝或磷酸铝混合注射,能够使抗原保存在注射部位,即“库存效应”,具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。氢氧化铝或磷酸铝对促进抗原的吸收具有重要作用,但铝盐佐剂的作用机理目前尚不完全清楚。一般认为铝胶体对蛋白质分子具有很好的吸附作用。
大量的临床免疫试验认为氢氧化铝胶体佐剂对TH2介导的体液免疫反应具有很强的激发作用,而对TH1介导的细胞免疫反应的作用较弱。此外,该种佐剂不适合作为肽抗原的佐剂。同其它佐剂一样,铝盐佐剂并不适合所有的抗原,与有些抗原混合注射后会引起局部炎症反应,有时还会形成肉芽肿。任何一种佐剂或疫苗的安全性都是I期临床实验的主要检测内容[1][2]。

 弗氏佐剂和油乳液
弗氏佐剂是含油佐剂的一种,其大的特点是具有较强的免疫增强效应,是应用为广泛的实验用佐剂。弗氏佐剂包括弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant, FCA)和弗氏不完全佐剂 (Freun’s incomplated adjuvant, FIA)。FCA除了含有矿物油等成分外,还含有灭活结核杆菌,对体液和细胞免疫系统具有很强的激活作用。FCA只用于初始免疫(Priming),在以后的加强免疫(Boost)中只用FIA。佐剂与抗原的体积一般各占50%。终所形成的抗原佐剂混合物是典型的“油包水”乳胶混合体。FCA能够刺激机体产生很强的体液免疫和细胞免疫应答,但也具有很强的副作用,特别是皮下注射时在注射部位引起很强烈的炎症和溃疡。由于注射部位强烈的副反应,该佐剂只用于实验目的的免疫研究,不适合用于制备疫苗。

 免疫刺激复合物(ISCOM)
ISCOM(Immunostimulating complex)即免疫刺激复合物。它是由瑞典的Iscote公司研发的一类以脂质(lipid)、皂素(saponin)为主的复合型佐剂。在ISCOM基质中,皂素分子(Quil A)结合于固醇类和磷脂酰胆碱,可形成稳定的网状结构,其直径在30-40nm间,能够与抗原的疏水部分结合,从而将其亲水面暴露于免疫细胞。其优点是能够快速、有效地将抗原提承给免疫系统。可以在免疫后迅速激活机体的细胞免疫应答和体液免疫应答的效果。
将含有ISCOM的疫苗注射接种后,T细胞应答首先在引流淋巴结中检测到,接种后50天,在骨髓中也有大量抗体产生细胞[3]。由于抗原提呈细胞的内体小泡和胞质溶胶的双重作用,含ISCOM的疫苗可以通过MHC-I和MHC-II两种途径将抗原提呈给免疫系统,同时激活CD4+和CD8+淋巴细胞[3]。含ISCOM的疫苗的另一个优点是可以经口服或是鼻腔接种获得免疫,且能达到在局部和全身黏膜表面诱导有效和特异的黏膜应答[4]。小鼠鼻腔接种流感ISCOM疫苗后,可诱导坚强的黏膜抗体和CTL应答反应并可抵抗攻击感染。口服ISCOM疫苗除了可以引发MHC-I介导的CTL活性外,还有全身性免疫应答,包括特异抗体、分泌型IgA抗体、CD8+T细胞应答等。而且,研究显示重复低剂量口服ISCOM疫苗不会引起免疫耐受[3]。
然而,ISCOM在使用上也存在一些限制性因素。它并不是一种可以和任何抗原都能形成复合体的佐剂。只有那些含疏水基团很多的抗原或免疫原才能与IS- COM形成复合体,含亲水基团多的抗原(免疫原)不适合与ISCOM佐剂混合制备疫苗[5]。

4 脂质体(Liposome)和类病毒颗粒(Virosome)
脂质体是一类以提高抗原输送和呈递为主要作用的佐剂。脂质体由磷脂和固醇类组成的含双层脂质分子的脂质球。其表面为疏水性结构,而内部为亲水性结构。其主要优点是脂质体膜对细胞膜具有很好的亲和性,容易将包被在脂质体上或内部的抗原(或编码抗原的DNA)成分输入到细胞内。目前可以根据要求制备直径不同的脂质球。也可以根据抗原分子的理化特性将抗原分子包被在脂质体的不同部位。如将含疏水性氨基酸较多的抗原插入脂双层中,而将含亲水性基团较多的抗原包裹在脂质球的中间区。脂质体疫苗可经粘膜免疫。由于脂质体膜与细胞膜的亲和性,非常有利于将包被的抗原提出给抗原处理细胞(Antigen proce- ssing cells, APC)并使抗原被溶酶体所降解进而通过MHC-I 和II 途径提呈给免疫系统,同时激发细胞和体液免疫应答反应。脂质体在制备过程中要求一定的技术性,其费用也较其它免疫佐剂高,目前对脂质体的应用研究还主要集中在医学研究方面,在兽医疫苗研究上的应用前景还具有一定的不确定因素。
类病毒颗粒是在脂质体的基础上发展起来的一种抗原输送技术。将流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶的部分氨基酸序列定向地插入双层脂质球的膜中,使这两种分子中能与宿主免疫细胞表面的唾液酸相结合的基团暴露在表面,将抗原或编码抗原的DNA/RNA包裹在内部。由于这种脂质球对细胞的主动亲和作用(由HA和神经氨酸酶介导),在形式上近似于病毒与宿主细胞的作用过程,因而被称作类病毒颗粒。其优点是有利于抗原或药物分子的定向传输。利用该技术制备的流感疫苗已经在临床上发挥很好的免疫保护效果[6]。

 CpG 佐剂
高等生物在进化过程中逐渐形成对入侵的微生物(包括病毒、细菌、真菌和寄生虫)的天然识别功能。主要是位于免疫细胞(各种淋巴细胞、吞噬细胞、树突细胞)膜上的结构识别受体(Pattern recognition receptors 即 Toll-like receptors)能够特异性地识别侵入体内地病原生物。能够被高等生物先天性免疫系统识别地病原成分很多,其中细菌和病毒的DNA(也包括RNA)是被免疫系统识别的主要成分之一。在多细胞生物,其DNA序列中的CpG基团多被甲基化,而微生物的核酸序列中含CpG基团较多,且多数为非甲基化。在真核细胞(尤其是具有免疫功能的细胞)表面有一种识别非甲基化CpG基团的受体(Toll-like receptor 9)。当该受体与非甲基化CpG结合后,就会激发天然的非特异性免疫应答反应(如细胞内干扰素、细胞坏死因子等合成增加,抗原处理细胞的功能增强等)。鉴于CpG基团对先天性免疫系统的激活作用,有人提出利用含有CpG基团的寡核苷酸链(Oligodeoxynucleotide,ODN)作为佐剂使用。近几年来,CpG ODN是在疫苗研究过程中被应用广泛的佐剂成分之一。大量的研究发现,CpG ODN对免疫细胞的激活作用主要决定于其序列组成。根据功能不同一般将CpG ODN分为 A、B和C三种类型[7]。A型CpG ODN(初被称作D型)序列中含有一个CpG基团,但在其3’末端含有多个G(Poly G)的重复序列。A型CpG ODN主要对NK淋巴细胞具有激活作用,能够刺激NK细胞合成和分泌TNF-γ因子。因而,A型CpG ODN的主要作用是激活细胞免疫应答反应。B型CpG ODN的序列内一般含有多个CpG基团,在序列的末端没有任何重复核苷酸序列。这种CpG ODN主要作用于B淋巴细胞,激活体液免疫应答反应。C型CpG ODN至少含有两个CpG基团,此外在序列的5’端还含有一个或两个TCG序列。C型CpG ODN对B淋巴细胞和NK细胞都有激活作用。由于高等动物之间遗传背景上的差异,一个CpG ODN在不同动物体内的作用可能存在很大的差异,如在小鼠体内具有很强免疫激活作用的CpG ODN在灵掌类动物体内的作用就可能很有限。因而在设计或选择CpG ODN佐剂过程还应该考虑终被免疫的个体遗传背景。目前处于临床实验阶段的CpG ODN佐剂种类很多,但还没有一种商品化的CpG ODN佐剂。

结束语
以上介绍的几种佐剂是目前免疫和疫苗研究过程中应用比较广泛的佐剂。随着越来越多的生物基因组序列的破译,将会使很多新发现的抗原成分被纳入疫苗研究过程中。然而提高亚单位抗原成分的免疫原性往往有赖于有效的佐剂。对佐剂的研究一直是疫苗研究过程中的重要环节。理想的佐剂应该是广谱、无副作用、对免疫系统具备有效的激活作用,同时便于生产和使用。目前还没有任何一种佐剂具备这些要求。随着人们对各种病原体的抗原成分的不断深入的了解和抗感染(抗病)免疫机理的认识,对佐剂的研究也会更具目标性。  

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