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感受态细胞制备原理与试验方法
点击次数:775 发布时间:2016-01-29
 

感受态细胞制备原理与试验方法

一、实验原理

    转化率的高低与受体菌的感受态有关,只有处于感受态的细胞才能摄取外源DNA分子。用预冷的CaCl2溶液处理对数期的细胞培养物,可诱导细菌产生短暂的感受态,在此期间,它们易于接受外来DNA。转化混合物中的DNA形成抗Dnase的羟基—钙磷酸复合物黏附于细胞表面,经42℃短暂热击后,促进细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂繁殖,被转化的细菌中,如果外源DNA中的基因在转化的细菌中得到表达,在选择性培养基上,可选出所需转化子。


二、实验方法
  (一)感受态细胞制备:
    1)从保藏的甘油管(-40℃)挑取大肠杆菌DH5α划线于LB平板上,在37℃恒温培养过(16-18h)。
    2)挑取单菌落于50mL LB培养基中37℃、200 r/min培养3-4h,至出现薄雾状菌悬液即可。
    3)将培养液置于冰上预冷15min,并间断轻轻摇动。
    4)将冷却的培养液倒入己在冰上预冷的50mL离心管中。
    5)在冷冻离心机中离心,4℃ 3000r/min 5min。
    6)弃上清、加入15mL冰上预冷的0.1mol/L CaCL2溶液,轻轻旋转,使细胞充分重新悬浮,冰上放置20-30min。
    7)于4℃3000r/min离心5min。
    8)弃上清,加入2mL冰上预冷的0.1mol/LCaCl2溶液,轻轻旋转,使细胞充分重新悬浮,5min后就可以用于转化实验,或添加保护剂,低温或超低温冷冻贮藏备用。

  (二)质粒转化:
    1)取出制备好的感受态细胞,迅速融化放在冰上。
    2)将感受态细胞分装成200μL/1.5mL离心管,每人3管,分别做阳性对照(加入5μL pKS质粒DNA),阴性对照(加超纯水5μL)和酶连产物转化(酶连产物5~20μL),用微量移液器轻轻吸打均匀、在冰上放置30min。
    3)热击  将离心管放置42℃水浴60-90s(勿动离心管)。
    4)冰浴  快速将离心管转移到冰上,放置l-2min(时间不能太长)。
    5)复苏  每管加800μL,SOC培养基,在37℃ 200r/min振荡培养50-60min,使细菌复苏,抗性得以表达。
    6)涂皿  将三种不同处理各取100μL 左右转化液徐布在含有4μL IPTG,40μL x-ga1和氨苄青霉素(Amp 50μg/mL)的平板上。
    7)倒置平板于37℃培养16-18h,观察实验结果并记录结果。

 
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