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bradford法原理及bradford法测蛋白浓度实验步骤
点击次数:4176 发布时间:2016-01-29
 

bradford法原理及bradford法测蛋白浓度实验步骤

    Bradford法是一种迅速、可靠的通过染色测定溶液中蛋白浓度的方法。又称作考马斯亮蓝法。是1976年由Bradford建立。是根据蛋白质与燃料相结合的原理设计的。

    具体Bradford法检测原理: Bradford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm检测.该方法用于大多数蛋白质的定量是比较的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100,SDS,NP-40等.

操作Bradford法的实验步骤:

1、Bradford法浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至200ml;此染液放4℃至少6个月保持稳定。

2、标准曲线蛋白质样本的制备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准,如果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常在20μg -150μg/100μl之间绘制标准曲线。

3、将待测样本溶于100μl缓冲溶液中,该缓冲溶液相同(好用PBS) 。

4、按照1:5用水稀释浓燃料结合溶液,如果出现沉淀,过滤除去。

5、每个样品家5ml稀释的燃料结合溶液,作用5-30分钟,燃料与蛋白结合,将由红色变为兰色,在595nm波长下测定其吸光度,注意显色反应不超过30分钟。

6、根据标准曲线计算待测样品的浓度。

 
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