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酵母细胞质粒提取详细步骤
点击次数:619 发布时间:2016-01-29
 

酵母细胞质粒提取详细步骤 

    酵母质粒提取可以用试剂盒提取,也可以直接用裂壁酶处理后采用碱裂解法提取质粒,缺点就是提取的量很少,还会容易出现假阳性现象,明明有却条带,检测却不正确。下面给大家介绍一种酵母质粒提取方法及详细步骤。

1. 接种单菌落(待检测酵母细胞)于25mLYNB(补加氨基酸 营养物)培养基中,30℃振荡培养大约24h。

2.第二天取一滴菌液于进行显微镜下观察,目镜用16,物镜用40倍观察细胞壁破碎前的状态,其成杆状,流动性比较下.

3.取10ml的培养酵母菌液,5000g离心3min,弃上清液.加入5ml的1倍TE悬浮.

4.将悬浮液倒入高压破壁仪的样品管中,利用高压破碎机进行破碎细胞壁,压力加到20Mpa,停留15s,降压,反复来回压3次.取出细胞液,取一滴于显微镜下观察,如果细胞呈不规则的球状时,而且其流动性 比较大,说明其细胞壁已经破碎成为原生质体.

5.取2个EP管,每管加入1.5ml上述的细胞液,12000g离心5min,收集原生质体.弃取上清液,每管加入300ul10%的SDS溶液,混匀冰浴5min,进行破原生质体.

6.然后加入150ul的tris饱和酚,和150ul的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1),混匀,12000g,离心10min.

7.将水相移到另一EP管中,加入等体积的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1), 混匀,12000g,离心10min.

8. 将水相移到另一EP管中,加入1/10体积的3M KAC溶液和2倍体积的无水乙醇,放入-20℃冰箱中

9.1h,12000g离心10min,倒出乙醇,等干燥后加入1ml的70%的无水乙醇,混匀,12000g,离心10min.

10.弃去乙醇,等室温干燥后,每管加入20ul的TE溶液(如要去处RNA酶,加入1ul的100mg/ml浓度的RNA酶),放入-20℃冰箱即可.

11.跑电泳进行检测是否从酵母菌中提出质粒了.

索莱宝提供有酵母质粒提取试剂盒,欢迎选购。

 
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