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免疫组化sabc法的原理和优点

发表时间:2016-03-07  |  点击率:2818

免疫组化sabc原理是亲和素(Avidin)存在于鸡蛋中,分子量67000。是一种碱性蛋白质,具有对生物素近乎于共价键的结合力。链霉亲和素是一种从链霉菌(Streptomyces Avidinii)培养物中所提取的蛋白质,分子量47000,不含糖链,等电点IP=6.0-6.5。和亲和素一样,也有四个生物素结合位点,亲和力高达10-15M。和亲和素相比,链霉亲和素更为。现在经过改进的亲和素等电点IP可以达到7.0,明显地消除了原碱性蛋白特征所引起的非特异性吸附。免疫组化sabc法集中体现了目前先进的免疫组化所必必具备的高敏感性、特异性及操作快速、简便的所有特征。


免疫组化sabc法的特点:
1.稳定性好:链酶亲和素结合生物素的亲和常数是抗原结合抗体反应的百万倍,二者结合形成复合物的解离常数很小。因此,SABC法在实际应用中,稳定性高,减少了操作误差,提高了检测的度
2.特异性高:链酶亲和素与生物素间的结合具有的亲和力,其反应呈高度特异性。因此,SABC法的多级放大作用不仅可以提高检测的灵敏度,同时还避免了非特异性干扰
3.高敏感性:生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合,形成生物素衍生物结构,该结构具有保持大分子物质的原生物活性功能,同时,每个链酶亲和素分子有四个生物素结合部位,可以多价形式同时结合生物素化的大分子衍生物和酶标记物。因此,SABC法具有多级放大作用,使其在免疫组化实验时大大地提高检测方法的灵敏度。


附免疫组化sabc法操作步骤:
1.切片脱蜡至水
2.新鲜配置3%H2O2,室温10分钟,灭活内源性酶,然后用蒸馏水冲洗2分钟三次
3.微波修复:将切片放入盛有PBS缓冲液(PH7.2-7.6)的杯子中,在微波炉里加热煮沸,微波炉中静置5分钟,拿出室温冷却6分钟,再微波续热至沸腾后完全室温冷却
4.滴加5%BSA封闭液,37℃反应30分钟。甩去多余液体,不洗
5.滴加一抗,4℃反应24小时左右。所配一抗的浓度为1µg/ml

6.PBS缓冲液(PH7.2-7.6)洗10分钟×3次,滴加生物素化二抗IgG(抗兔或抗鼠)37℃反应30分钟
7.PBS缓冲液(PH7.2-7.6)洗10分钟×3次,滴加试剂SABC,37℃反应30分钟,PBS洗30分钟×3次
8. DAB室温显色,镜下控制反应时间,蒸馏水洗涤
9. 滴加苏木素轻度复染60秒,蒸馏水洗涤后浸入饱和Na2HPO4溶液中2分钟,取出后洗涤,37℃恒温箱干燥经过12个小时左右,中性树胶封片。

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