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基因组DNA提取常见问题分析 solarbio

发表时间:2010-10-24  |  点击率:5054

 

基因组DNA提取常见问题分析
 

常见问题
可能原因
建议解决方案
洗脱产物的DNA量很少或没有
所提样品材料老化或反复冻融导致基因组DNA含量下降
应选择新鲜的样品材料,如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或幼嫩的植物组织等,不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70℃低温保存,以免DNA降解。
样品破壁或裂解不完全导致基因组DNA未充分释放
动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆,G+细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、酵母破壁酶或机械方式协助破壁,不同样品的细胞破壁方式可参照前面的详细介绍。
样品量过多导致细胞裂解不充分
加样量过多使裂解液和样品混合不均匀,细胞裂解不充分。不同来源样品的加样量请参照详细操作步骤。
DNA吸附不充分
如在上吸附柱前末加无水乙醇,或用低浓度乙醇代替无水乙醇,则导致DNA不能充分沉淀,与硅胶膜吸附不彻底,因此应在样品裂解后加适量无水乙醇,再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。
DNA洗脱不适当
洗脱液pH值过低会降低洗脱效率,应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间;洗脱体积若小于30μ,则不易完全浸透硅胶膜,使DNA不能全部洗脱下来,因此洗脱液体积应大于30 μl,同时如洗脱液体积过大,超过200μl,则所得的DNA浓度会降低,但DNA总量不会减少;洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70水浴预热,加入洗脱液后在室温静置2-5分钟,可提高洗脱效率,提高基因组DNA的产量。
提取的基因组DNA有降解
选取的材料不新鲜或反复冻融,采集材料后未及时处理或末低温保存
陈旧血液、老化菌液等不新鲜的材料中,细胞凋亡导致DNA降解,或低温保存的样品反复冻融导致细胞破碎,内源核酸酶降解DNA,因此应选择新鲜的材料样品,不能及时处理则低温保存,运输过程中亦应使用干冰。
未能有效抑制内源核酸酶作用
某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆,研磨过程中应随时补充液氮,并在样品末完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。
操作过于剧烈导致DNA被机打断
预处理的样品加入细胞裂解液后,所有操作应尽量柔和,避免振荡、搅拌等剧烈机械力对DNA片段的损伤。
提取的基因组DNA中有RNA污染
实验过程中没有有效使用RNase A
应严格按照实验操作要求使用,即加入裂解液的同时加入20μl RNase A溶液,室温放置10分钟。
RNAase A可能失活
RNase A须在-20℃下保存,低温保存时RNase A比较稳定,不易失活,但如果反复冻融会导致RNase A降解失活,所以应妥善保存。
提取的基因组DNA不能顺利地进行后续试验
样品量过多导致细胞裂解不充分
样品量过多会使裂解液不能快速有效地与样品充分混合,从而导致样品裂解不彻底,残留大量蛋自、多糖、脂类等杂质,为后续的上吸附柱分离纯化造成影响。应加入适当量的样品材料,具体数量请参照详细操作步骤。
DNA在洗脱前有大量乙醇残留
有机溶剂乙醇可严重抑制内切酶、DNA聚合酶的活性,而在DNA过柱洗涤过程中需使用含有乙醇的漂洗液,因此在洗脱DNA前,—定要充分去除残留的乙醇,可重复离心,或将吸附柱置于室温或50℃温箱中烘干5-10分钟,再加洗脱液。

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