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基因组DNA提取常见问题分析 solarbio

更新时间:2010-10-24  |  点击率:6605

 

基因组DNA提取常见问题分析
 

常见问题
可能原因
建议解决方案
洗脱产物的DNA量很少或没有
所提样品材料老化或反复冻融导致基因组DNA含量下降
应选择新鲜的样品材料,如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或幼嫩的植物组织等,不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70℃低温保存,以免DNA降解。
样品破壁或裂解不*导致基因组DNA未充分释放
动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆,G+细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、酵母破壁酶或机械方式协助破壁,不同样品的细胞破壁方式可参照前面的详细介绍。
样品量过多导致细胞裂解不充分
加样量过多使裂解液和样品混合不均匀,细胞裂解不充分。不同来源样品的加样量请参照详细操作步骤。
DNA吸附不充分
如在上吸附柱前末加无水乙醇,或用低浓度乙醇代替无水乙醇,则导致DNA不能充分沉淀,与硅胶膜吸附不*,因此应在样品裂解后加适量无水乙醇,再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。
DNA洗脱不适当
洗脱液pH值过低会降低洗脱效率,应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间;洗脱体积若小于30μ,则不易*浸透硅胶膜,使DNA不能全部洗脱下来,因此洗脱液体积应大于30 μl,同时如洗脱液体积过大,超过200μl,则所得的DNA浓度会降低,但DNA总量不会减少;洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70水浴预热,加入洗脱液后在室温静置2-5分钟,可提高洗脱效率,提高基因组DNA的产量。
提取的基因组DNA有降解
选取的材料不新鲜或反复冻融,采集材料后未及时处理或末低温保存
陈旧血液、老化菌液等不新鲜的材料中,细胞凋亡导致DNA降解,或低温保存的样品反复冻融导致细胞破碎,内源核酸酶降解DNA,因此应选择新鲜的材料样品,不能及时处理则低温保存,运输过程中亦应使用干冰。
未能有效抑制内源核酸酶作用
某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆,研磨过程中应随时补充液氮,并在样品末*解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。
操作过于剧烈导致DNA被机打断
预处理的样品加入细胞裂解液后,所有操作应尽量柔和,避免振荡、搅拌等剧烈机械力对DNA片段的损伤。
提取的基因组DNA中有RNA污染
实验过程中没有有效使用RNase A
应严格按照实验操作要求使用,即加入裂解液的同时加入20μl RNase A溶液,室温放置10分钟。
RNAase A可能失活
RNase A须在-20℃下保存,低温保存时RNase A比较稳定,不易失活,但如果反复冻融会导致RNase A降解失活,所以应妥善保存。
提取的基因组DNA不能顺利地进行后续试验
样品量过多导致细胞裂解不充分
样品量过多会使裂解液不能快速有效地与样品充分混合,从而导致样品裂解不*,残留大量蛋自、多糖、脂类等杂质,为后续的上吸附柱分离纯化造成影响。应加入适当量的样品材料,具体数量请参照详细操作步骤。
DNA在洗脱前有大量乙醇残留
有机溶剂乙醇可严重抑制内切酶、DNA聚合酶的活性,而在DNA过柱洗涤过程中需使用含有乙醇的漂洗液,因此在洗脱DNA前,—定要充分去除残留的乙醇,可重复离心,或将吸附柱置于室温或50℃温箱中烘干5-10分钟,再加洗脱液。