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质粒提取常见问题分析

发表时间:2010-10-24  |  点击率:5554

 

质粒提取常见问题分析
 

常见问题
可能原因
建议解决方案
未提出质粒或质粒得率较低
大肠杆茵老化
请涂布平板培养后,重新挑选新茵落进行液体培养。
质粒拷贝数低
由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低,可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
菌体中无质粒
有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在,经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如,柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定,因此不要频繁转接,每次接种时应接种单菌落。另外,检查筛选所用抗生素种类和工作浓度是否正确。
碱裂解不充分
使用过多的菌体培养液,会导致菌体裂解不充分,此时可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒,提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液P1、P2和P3,可能有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。
溶液使用不当
溶液P2和P3在温度较低时可能出现浑浊,应置于37℃保温一段时间,直至溶液变为清亮后才能使用。
质粒未全部溶解(尤其质粒较大时)
洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。
洗脱液加入位置不正确
洗脱液应加在硅胶膜中心部位,确保洗脱液能完全覆盖硅胶膜的表面以达到大洗脱效率。
洗脱液不合适
DNA只在低盐溶液中才能被洗脱,如TE和水;洗脱液pH值过低会降低洗脱效率,应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间,当用水洗脱时确保其pH值在此范围内;洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70水浴预热,加入洗脱液后在室温静置2-5分钟,可提高洗脱效率。
洗脱体积太小
洗脱液体积若小于30μl,则不易完全浸透硅胶膜,使洗脱效率降低;洗脱液体积若超过200μl,则所得的DNA浓度会降低,但DNA总量不会减少。为了得到较高的洗脱效率可以适当增大洗脱液体积。
洗脱时间过短
洗脱时间对回收率也会有—定影响,洗脱时放置2分钟可达到较好的效果。
碱裂时间过长
加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。
质粒纯度不高
混有蛋白
菌体不要过量。经溶液P1、P2和P3处理并离心后溶液应为澄清的,如果还混有微小蛋白悬浮物,可再次离心去除。
混有RNA
RNase A处理不彻底,请减少菌体用量或加入溶液P3后室温放置一段时间。若溶液P1已保存6个月以上,请在溶液P1中添加RNaseA。
混有基因组DNA
加入溶液P2和P3后应温和混匀,如果剧烈振荡,可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠,无法温和混匀,请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解,培养时间不要超过16小时。
含大量核酸酶的宿主菌
宿主菌含大量核酸酶,在质粒提取过程中降解质粒DNA,影响提取质粒DNA的完整性,好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌,如DH5α和*0。
质粒的二聚体和多聚体形式
是在质粒复制过程中形成的,与宿主菌相关,电泳可检测出多条条带,单酶切处理后可变成单一条带。
乙醇残留
漂洗液洗涤后应离心尽量去除柱中残留液体,并晾干吸附柱。如果DNA已经洗脱出来,可以用酒精沉淀DNA并风干,然后再溶解。

 

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