质粒提取常见问题分析

未提出质粒或质粒得率较低

大肠杆茵老化

请涂布平板培养后，重新挑选新茵落进行液体培养。

质粒拷贝数低

由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

菌体中无质粒

有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选所用抗生素种类和工作浓度是否正确。

碱裂解不充分

使用过多的菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，此时可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可能有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。

溶液使用不当

溶液P2和P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温一段时间，直至溶液变为清亮后才能使用。

质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）

洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

洗脱液加入位置不正确

洗脱液应加在硅胶膜中心部位，确保洗脱液能*覆盖硅胶膜的表面以达到大洗脱效率。

洗脱液不合适

DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如TE和水；洗脱液pH值过低会降低洗脱效率，应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间，当用水洗脱时确保其pH值在此范围内；洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率。

洗脱体积太小

洗脱液体积若小于30μl，则不易*浸透硅胶膜，使洗脱效率降低；洗脱液体积若超过200μl，则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。为了得到较高的洗脱效率可以适当增大洗脱液体积。

洗脱时间过短

洗脱时间对回收率也会有—定影响，洗脱时放置2分钟可达到较好的效果。

碱裂时间过长

加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。

质粒纯度不高

混有蛋白

菌体不要过量。经溶液P1、P2和P3处理并离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物，可再次离心去除。

混有RNA

RNase A处理不*，请减少菌体用量或加入溶液P3后室温放置一段时间。若溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNaseA。

混有基因组DNA

加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。

含大量核酸酶的宿主菌

宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5α和*0。

质粒的二聚体和多聚体形式

是在质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。

乙醇残留

漂洗液洗涤后应离心尽量去除柱中残留液体，并晾干吸附柱。如果DNA已经洗脱出来，可以用酒精沉淀DNA并风干，然后再溶解。