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DNA产物纯化试剂盒简介 solarbio

发表时间:2010-10-24  |  点击率:5081

 

DNA产物纯化试剂盒简介
 
对于TA克隆、酶切或者直接测序等试验来说,纯化PCR产物或酶切产物是非常必要的。以TA克隆为
例,其成功率跟目的片段的纯度高低具有重要关系。虽然未经过纯化的PCR产物也可以跟载体连接,
但会增加筛选阳性克隆的难度,因为PCR产物中的dNTP和引物等可能也会跟载体连接。在进行连接
试验时,这些非特异性的产物会跟特异性产物相互竞争,从而导致连接效率下降。
 
DNA片段纯化回收原理
在获得DNA片段后,一般采用吸附材料的方法去除杂质和纯化DNA片段。目前大多数生物公司都采用硅基质吸附材料,可特异性吸附核酸,有效去除体系中的蛋白、盐类和有机物质。
 
DNA片段纯化回收的种类
根据DNA片段在待回收体系中是否为单一条带,可将DNA片段纯化回收分为两大类:直接纯化和切胶纯化。Solarbio公司针对这两种纯化方法开发出DNA产物纯化回收试剂盒和琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒,可以满足不同的试验要求。
 
直接纯化
适用于有单一DNA片段或溶液中所有DNA片段都需要回收。对于一些下游试验如测序、SNP分析等,需要从PCR或酶切产物中去除盐离子、dNTP、蛋白、引物等杂质,因为这些成分会抑制后续试验的酶活性。
切胶纯化
适用于选择性回收溶液中多种DNA片段中的一种。对于后续试验,采用切胶纯化是有效的方法。通过琼脂糖凝胶电泳可以分开特异性条带和非特异性条带,在紫外光下快速有效地切下目的片段所在位置的凝胶,然后通过进一步的纯化就可以得到目的片段。对于要求较高的后续试验,建议采用切胶纯化的方法,这样得到的片段纯度比直接纯化要高一些。
 
DNA片段回收纯化的一般流程
一、反应液收集
PCR反应液
1、如要进行后续TA克隆,请选用能在扩增产物末端加A尾的聚合酶,如Taq酶或Hotstart Taq酶。
2、如对扩增序列保真度要求高,请选用具高保真扩增能力的聚合酶,如Pfu酶。
3、由Pfu酶扩增得到的PCR产物不带A尾,如要进行基因克隆,可选用加A反应液对其添加A尾,从而保证克隆效率。
酶切反应液
1、酶切时所加的DNA溶液体积不能太大,否则DNA溶液中其他成分会干扰酶切反应。
2、双酶切反应条件选择可从两种酶的反应温度以及反应buffer来决定:从反应温度考虑,应按照先高温后低温的顺序进行;从反应buffer考虑,应按照先低盐后高盐的顺序进行。
 
二、电泳检测
PCR或酶切反应结束,一般通过凝胶电泳检测扩增或酶切结果。凝胶电泳分为琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种,其中聚丙烯酰胺凝胶电泳普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸,琼脂糖凝胶在分离同工酶及其亚型、大分子核酸等应用较广。这两种疑胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、常用约分离纯化和鉴定核酸的方法。根据琼脂糖的溶解温度,把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖的熔点为62-65,溶解后在37下维持液体状态约数小时,主要用于DNA片段的回收、质粒与外源性DNA的快速连接等。
 
DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率与琼脂糖浓度、DNA分子量及构象、电泳缓冲液、电场强度等因素有关。一般来说,DNA片段越大或琼脂糖浓度越大,其迁移速率越小;而电场强度越高,其迁移速率越大。
 
分子生物学实验中常用的电泳缓冲液主要有三种:TAETBETPETBETPE缓冲容量高,DNA分离效果好,但TPE会导致DNA片段回收时含磷酸盐浓度高,容易使DNA沉淀。TAE缓冲容量低,但价格较便宜,TBE缓冲液含有的EDTA可螯合二价阳离子,可抑制DNase活性,防止PCR扩增产物降解。
 
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体在催化剂TEMED和过硫酸铵的作用下聚合形成长链,并在交联剂N,N’-亚甲双丙烯酰胺参与下,聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。
 
聚丙烯酰胺凝胶电泳特别适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1kbDNA片段和DNA序列分析,长度仅相差0.2500bp相差1bp)的核苷酸分子即能分离。
 
聚丙烯酰胺分辨率较琼脂糖凝胶分辨率高,按性质可分为变性与非变性两种。前者主要用于单链DNA的分离及纯化,后者则主要用于双链DNA的分离及纯化。
 
核酸电泳指示剂
核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰及二甲苯青两种。溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色,在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中,溴酚兰的迁移率分别与1kb0.6kb0.2kb0.15kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈兰色,它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时,其迁移速率分别与2kb1.6kb的双链线性DNA大致相似。指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。载样缓冲液的作用有:①增加样品密度,使其比重增加,以确保DNA均匀沉入加样孔内。②在电泳中形成肉眼可见的指示带,可预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色,使加样操作更方便。
 
核酸电泳染色剂
核酸电泳后,需经染色才能显现出带型,常用的是溴化乙锭染色法,其次是银染法。1、溴化乙锭染色法:EB是一种荧光染料,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间,在紫外线激发下,发出红色荧光。2、银染法:银染色液中的银离子(Ag+可与核酸形成稳定的复合物。然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒。可把核酸电泳带染成黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色,也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比EB200倍,但银染后,DNA不宜回收。
 
三、DNA片段纯化
根据电泳结果,确定待回收的DNA片段在回收体系中是否为单一条带后,可分别选择不同的DNA片段纯化试剂盒。如果目的DNA片段在回收体系中为特异的单一条带,则可以选择DNA产物纯化回收试剂盒;如果在回收体系中除口的DNA片段外还有其它非特异性DNA片段,则需要选择琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。
 

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