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单宁含量试剂盒说明 微量法 技术文章

发表时间:2019-06-04  |  点击率:504

货号:MS1516                                                 规格:100 管/96 样

单宁含量试剂盒说明书 微量法

正式测定前取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

单宁是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物,又称植物多酚。具有独特的化学性质和 多种生理活性,如能与蛋白质、生物碱、多糖结合;能与多种金属离子发生络合或静电作用; 具有止血、抑制微生物、抗过敏、抗突变、抗肿瘤、抗衰老等生理活性。

测定原理:

单宁在碱性环境下与磷钼酸反应,生成蓝色化合物,在 760nm 处有大吸收峰。

自备实验用品及仪器:

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵和蒸 馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一:液体 4mL× 1 瓶,4℃保存;

试剂二:液体 3mL × 1 瓶,4℃保存;

单宁的提取:

按照组织质量(g):蒸馏水体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 蒸馏水),充分匀浆后转移到 EP 管中,80℃水浴提取 30min, 8000 g,25℃离心 10 min,取 上清液待测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 760nm 处,蒸馏水调零;试剂一和试剂二 37℃预热 10min 以上; 

2、操作表:

试剂名称(µL)      对照管      测定管

样本                        5

蒸馏水            135        130

试剂一           35         35

       混匀,室温静置 5min

试剂二           30          30

       混匀,室温静置 30min,760nm 处读取吸光值 A,Δ A=A测定 - A对照,对照管只要做一管。

单宁含量计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1、标准条件下测定的回归方程为 y = 1.6418x + 0.0134;x 为标准品浓度(mg/mL),y 为 ΔA (A测定 - A对照)。

2、按样本鲜重计算:

单宁含量(mg /g 鲜重)= [(ΔA - 0.0134) ÷1.6418 × V1] ÷(W × V1 ÷ V2)= 0.609 × (Δ A - 0.0134) ÷ W。

3、按样本蛋白浓度计算:

单宁含量(mg/mg prot) = [(ΔA - 0.0134) ÷1.6418 × V1] ÷ (V1 × Cpr) = 0.609 × (ΔA - 0.0134) ÷ Cpr。

V1:加入样本体积,0.005mL;V2:加入提取液体积,1mL; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W: 样本鲜重,g。 

b.用 96 孔板测定的计算公式如下:

1、标准条件下测定的回归方程为 y = 0.8209x + 0.0134;x 为标准品浓度(mg/mL),y 为 ΔA(A测定  - A对照)。

2、按样本鲜重计算: 单宁含量(mg/g 鲜重) = [(ΔA - 0.0134) ÷ 0.8209 × V1] ÷ (W × V1 ÷ V2) = 1.218 × (ΔA - 0.0134) ÷ W。

3、按样本蛋白浓度计算: 单 宁 含 量 (mg/mg prot)= [(Δ A-0.0134)÷0.8209 × V1]÷(V1 × Cpr)=1.218 × (ΔA-0.0134)÷Cpr。

V1:加入样本体积,0.005mL;V2:加入提取液体积,1mL; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W: 样本鲜重,g。 

注意事项:

1、 ΔA 控制在 0.02 ~ 0.5 范围内,若ΔA 大于 0.5,将样本提取上清液用蒸馏水稀释 10 倍后检 测,计算公式中乘以相应稀释倍数。

2、 标准曲线线性范围为:0.025mg/mL ~ 0.5mg/mL。

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