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Western Blot实验中滤纸和膜的选择 应用 用法

发表时间:2012-02-01  |  点击率:12339

 

Western Blot实验中滤纸及膜的选择
      
Western Blot实验中滤纸及膜的选择
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1、NC膜、PVDF膜、尼龙膜怎样鉴别?
解答:尼龙膜是较理想的核酸固相支持物,有多种类型;*纤维素(NC)膜是目前应用广的一种固相支持物,价格便宜;PVDF膜介于二者之间。
就结合能力而言:尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480-600μg/cm2,可结合短至10bp的核酸片段;*纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80-100μg/cm2,对于200bp的核酸片段结合能力不强;PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125-300μg/cm2。
就温度适应性而言:尼龙膜经烘烤或紫外线照射后,核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合;*纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA,结合不牢固;PVDF膜结合牢固,耐高温,特别适合于蛋白印迹。
就韧性而言:尼龙膜较强;*纤维素膜较脆,易破碎;PVDF膜较强。
就重复性而言:尼龙膜可反复用于分子杂交,杂交后探针分子可经碱变性被洗脱下来;*纤维素膜不能重复使用;PVDF膜可以重复使用。
2、在做Western Blot时,PVDF膜用甲醇浸泡的目的?
解答:PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
3、检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗?
解答:可以。
4、转膜后经丽春红染色的条带,为什么大分子蛋白的一端(即点样的一侧)的转膜不是很好?
解答:这是正常的,大分子的蛋白转移的慢,延长转移时间和电流,大分子一端就会好的多,但是小分子的就有可能会变淡。
5、膜一般要如何处理?
解答:一般用甲醇泡泡就可以了。
6、上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到佳效果。
解答:无要求。
7、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢?是有的成分不对吗?
解答:没什么问题,就是胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来,在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜,胶里的水分被蒸发,采用保鲜膜包上也可以;也可能母液(30%聚丙酰胺)有问题,可以重新配制一份观察;能够替换的试剂,尽量换一下,选用好的试剂,避免找麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。
8、膜、滤纸、胶大小有何讲究?
解答:如果是用的是半干转,顺序为:阴极-滤纸-胶-膜-滤纸。滤纸的长宽比胶的长宽小1-2mm,而膜的长宽分别比胶的长宽大1-2mm。禁忌:上下两层滤纸因为过大而相互接触,这样会短路,电流不会通过胶和滤纸。
9、蛋白质的分子量跨度很大,如要分离小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好吗?
解答:这么广的分布不好转移,一般建议:21kd和66kd可以一起转,12%SDS-PAGE,湿转36V,3-5hrs就可以了, 可以根据实验室的经验调节;170kd 用7%SDS-PAGE, 48V 10hrs-16hrs。
10、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上,转移效率低怎么样解决?
解答:可以考虑:转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度)(优化的转移缓冲液,可以参考《蛋白质技术手册》),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和NC膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也是为了增加转移效率;用的转移膜,或使用小孔径的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交联;低浓度胶,如低至6%。太大时还可以考虑用琼脂糖胶;提高转移电压/电流;增加转移时间。
11、如何选择合适的蛋白杂交膜?
解答:蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素,我们要量体裁衣,从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。
*纤维素膜:*纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下,大多数带负电荷的蛋白质会与*纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起,虽然这其中的机制还不是十分清楚,但由于*纤维素膜的这个特性,而且易于封闭非特异性结合,从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下,结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小,要选择不同孔径的*纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于0.1μm,蛋白的转移就很难进行了。因此,我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的*纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜,小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了,如果用0.45μm的膜就会发生“Blowthroμgh”的现象。从膜的质地上来看,重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。*纤维素膜的结合能力主要与膜的*纤维素的纯度有关,市场上有些*纤维素膜通常会有大量的醋酸纤维素,因而降低了蛋白的结合量。S&S公司采用的是100%纯度的*纤维素,保证了大的蛋白结合量,可达80-150μg/cm2。由于100%的纯度,因而也大大减少了非特异性的结合,降低杂交背景,无需高严谨度的洗脱步骤。其次,膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的*纤维素膜比较脆,漂洗一两次就会破损,不能反复使用。
PVDF转移膜:PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质,通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质,而且可以分离小片段的蛋白质,初是将它用于蛋白质的序列测定,因为*纤维素膜在Edman试剂中会降解,所以就寻找了PVDF作为替代品,虽然PVDF膜结合蛋白的效率没有*纤维素膜高,但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品,一直沿用至今。PVDF膜与*纤维素膜一样,可以进行各种染色和化学发光检测,也有很广的适用范围。这种PVDF膜,灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高,非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。
离子交换型转移膜:*纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的,还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE(二乙氨乙基)修饰的纤维素制成的DEAE阴离子交换膜同样可以 作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团,包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下,DEAE基团都能带电荷,在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其适的pH环境为5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。这种0.45μm孔径的DEAE膜,除了可以做Western Blotting外,还可以用于核酸结合研究。
还有一种离子交换型膜是羧甲基(CM)修饰的纤维素膜,它可以结合蛋白和多肽分子,以及其他的一些带正电荷的样品,适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来,用于氨基酸系列分析或微测序。
杂交膜转印膜*纤维素膜NC与PVDF膜的区别
      杂交膜转印膜*纤维素膜NC与PVDF膜的区别
1. *纤维素膜
*纤维素膜是蛋白印迹广泛使用的转移介质,对蛋白有很强的结合能力,而且适用于各种显色方法,包括同位素,化学发光(Luminol类)、常规显色、染色荧光显色;背景低,信噪比高。NC的使用也很简便,比如不需要甲醛预处理,只要在无离子水面浸润排出膜内气泡,再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了;比如NC很容易封闭,也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间,不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆,又容易卷,操作要小心,不适合用于需要多次重复清洗的用途--因为经不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径,通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜,小于20KD的话建议选择0.2um的,如果小于7KD的话好选择0.1um的膜。另外还要注意选择纯的NC--混有含醋酸纤维(CM)的NC结合力会有所降低。另外提醒一句:由于NC上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替,因此在封闭时好使用较温的Tween20,而且浓度不要超过0.3%(据说0.05%效果好)。一般而言,NC越纯,其蛋白结合能力就越高,所以要增加WB的灵敏度分辨率,提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。如果NC搀杂一些醋化纤维素--这在前面已经提到,会影响蛋白质结合。Protran由于是纯NC,比较脆,机械耐受力欠佳,需要小心操作,如果担心自己“粗手粗脚”,那么就可以考虑一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著称的BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。卷膜肯定是实惠的选择,只不过要自己动手裁剪--切记,必须带手套操作。
*纤维素膜生产商:
GE WHATMAN BA83 BA85  价格  1950.00/卷  有现货
GE RPN303C
PALL 66485 常用的NC膜 30cm*3m/卷超低特价:1250.00/卷现货
 
2. PVDF
与*纤维素膜相比,PVDF膜在蛋白质截留能力,机械强度化学相容性上都更优越的性能。市售*纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜结合量是100-200μg/cm2(而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍!)。但是PVDF膜大的优点不仅于此:更好的机械强度化学耐受性使PVDF膜在各种染色应用多重免疫检测中成为理想选择;而且单个凝胶的泳道复本可用于多种目的,特别是需要做N端蛋白测序,在相当“严酷”的清洗条件下,当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下PVDF膜依然保持本色,笑傲江湖。所以PVDF也是要做蛋白测序的*选择。但不适合荧光。PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理(不超过15秒)再用缓冲液平衡,才能用,而且适用过程中万一干了也要同样程序再处理(不过要真出现这种问题也是自己欠扁,谁要你不小心呢,转膜前处理也就罢了,转膜后再这样处理可能会影响后继的抗体识别呢)。PVDF膜同样分0.45um0.2um的,后者孔径小,对小分子蛋白有较好的拦截吸附,背景可能会比前者稍高。
pvdf膜生产商:
MILLIPORE 特价 常年 现货
IPVH00010  0.45um  1650.00/卷
ISEQ00010  0.22um   2050.00/卷
 
PALL 66543      2150.00/卷
 
卷膜经济实惠,裁剪剩下的边角料还可以用来做点杂交。再次强调的是,疏水PVDF膜在用前必须经过50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理几分钟,待膜变成半透明后用纯水漂洗一下,转入电泳缓冲液平衡才能用

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