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原代组织细胞的解离

发表时间:2010-01-18  |  点击率:1454

原代组织细胞的解离
从原代组织上获取单个细胞悬液的常用方法是利用酶的解聚作
用。尽量缩短用酶处理细胞的时间,以获得高的存活率。按下
面的方法解聚整个组织,以获得大量细胞。
胰酶
1.先去除无关组织,然后用灭菌的解剖刀或剪刀将组织切成  
 3-4mm大小碎块。通过在不含钙镁的平衡盐溶液进行重悬来清 
洗组织碎块。待组织碎块沉降后去掉上清液。重复清洗2-3次。
2.将装有组织碎块的容器置于冰上,去掉所有上清液。在不含钙
镁的平衡盐溶液中加入0.25%胰酶(每100mg组织大约需要
1ml 胰酶)。
3.在4℃ 下孵育6-18小时,使低活性的胰酶尽量渗入组织。
4.缓慢倒掉胰酶。在37℃ 下将残余的胰酶与组织碎块共同孵育 
 20-30分钟。
5.向组织碎块加入温热的完全培养基,并轻轻地吹吸以分散组 
 织。如果使用无血清培养基。还应加入大豆胰酶抑制剂。
6. 用灭菌的不锈钢网(100-200μm)过滤细胞悬浮液,直至所有
组织完全散开。计算细胞个数,然后接种细胞进行培养。
胶原酶
1.用灭菌的解剖刀或剪刀将组织切成3-4mm大小碎块。用Hanks平衡
盐溶液(HBSS)将组织碎块清洗数次。
2.加入胶原酶(50-200单位/ml胶原酶HBSS)。
3.在37℃ 下孵育4-18小时。加入3mM CaCl2 可以提高解离效率。
4.用灭菌的不锈钢网或尼龙网过滤细胞悬浮液,将离散的细胞和
组织片段与大块的组织碎片分离。如需进一步解离,可向组织片
段中加入新鲜的胶原酶。
5.通过离心HBSS清洗细胞悬浮液数次。
6.用培养基重悬细胞。计算细胞个数,然后接种细胞进行培养。
分散酶
1.用灭菌的解剖刀或剪刀将组织切成3-4mm大小碎块。用不含钙
镁离子的平衡盐溶液清洗组织碎块数次。
2.加入分散酶(0.6-2.4单位/ml分散酶不含钙镁的平衡盐溶液)。
3.在37℃下孵育20分钟至数小时。
4.用灭菌的不锈钢网或尼友网过滤细胞悬浮液,将离散的细胞和
 组织片段与大块的组织碎片分离。如需进一步解离,可向组织片
 段中加入新鲜分散酶。
5.通过离心平衡盐溶液清洗细胞悬浮液数次。
6.用培养基重悬细胞。计算细胞个数,然后接种细胞进行培养。

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