RNA纯化及获得

RNA纯化及获得
纯化要求
RNA样品中不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的有机溶剂和过
高浓度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分
子的污染。排除DNA分子的污染。
纯化方法及沉淀
1、有机溶剂抽提法
氯仿抽提：在使用RNA提取试剂进行RNA提取时，常使用氯仿进行
抽提，以去除蔗糖、蛋白等杂质，并促进水相与有机相的分离，从
而达到纯化RNA的目的。
沉淀：氯仿抽提RNA后，一般采用异丙醇或乙醇来沉淀水相RNA。
加入0.6倍水相体积的异丙醇或与水相等体积的异丙醇，室温沉淀
20-30分钟，高速离心，可获得RNA沉淀。
洗涤沉淀：加入无RNase的75％乙醇，将RNA沉淀振荡悬浮，使
RNA沉淀中的盐离子被充分溶解。然后再离心10-30分钟，再次沉淀
RNA。离心后，小心倒掉上清（注意不要倒出RNA沉淀），随后快速离
心1-2秒，将残留在管壁上的乙醇收集到管底后，用小枪头吸净，超
净台中风干1-2分钟（注意不要晾得太干，否则RNA沉淀不易溶解）。
溶解沉淀：加入适量的RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。
2、硅基质吸附法
随着实验方法的改进，现已发展出一种采用吸附材料纯化核酸的
方法。目前较常见的有：硅基质吸附材料、阴离子交换树脂和磁
珠等。硅基质吸附材料因其具有可特异吸附核酸，使用方便、快
捷，不使用有毒溶剂如苯酚、氯仿等优点，成为核酸纯化的。
Solarbio公司总RNA提取试剂盒就是采用硅基质吸附达到RNA分离
纯化目的。通过专一结合RNA的离心吸附柱和*的缓冲液系统，
使样品在高盐条件下与硅胶膜特异结合，而蛋白、有机溶剂等杂质
不能结合到膜上而被洗脱，盐类则被含有乙醇的漂洗液洗涤，后
用RNase-free ddH2O将RNA从硅胶膜上洗脱下来。
一些特殊组织的RNA提取
纤维组织：心脏/骨骼肌等纤维组织提取RNA的关键在于*破碎
组织。这些组织细胞密度低，单位重量的组织中RNA含量较低，建
议增加起始量。此外，一定要在液氮中将组织*磨碎。
蛋白/脂肪含量高的组织：脑或植物脂肪含量高，酚/氯仿抽提后，
上清含白色絮状物。必须用氯仿再次对上清进行抽提。
核酸RNase含量高的组织：脾、胸腺等组织的核酸和RNase含量很
高。在液氮中研磨，再快速匀浆，能有效灭活RNase，如加入裂解
液后过于粘稠，酚/氯仿抽提不能有效分层，则加入更多裂解液可
以解决此问题。多次酚/氯仿抽提可以去除更多残留的DNA。如果
加入乙醇后马上有白色沉淀形成，表明可能有DNA污染，可以在
核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提或者用DNaseI消化，去除DNA
污染，植物组织和真菌组织：植物组织和真菌组织比动物组织更为
复杂，一般选择在液氮条件下对样品进行研磨，以避免内源RNase
降解RNA。如果RNA降解问题不能解决，大多数情况下是样品中含
有的杂质所致。许多植物和真菌中所含杂质如多糖、多酚等都会残
留，因为这些杂质分子与RNA有一些相似性，可与RNA同时沉淀或
者吸附，因此在植物和真菌组织的提取中，需要用一些特别的步骤
或者特别的试剂来去除多糖多酚等杂质的干扰和污染。