RNA评价与鉴定

RNA评价与鉴定
提取得到RNA溶液后，我们需要对RNA进行相关的质量检测，以确
定它是否符合后续实验的要求。RNA用于不同的后续实验，对其质
量要求不尽相同。cDNA文库构建要求RNA完整且无酶等抑制物残
留；Northern blot实验对RNA完整性要求较高，对酶反应抑制物残
留要求较低；RT-PCR实验对RNA完整性要求不太高，但对酶反应
抑制物残留要求严格。因此在进行不同的实验时应选择不同的方法
纯化RNA，以达到佳的实验效果。
RNA得率检测——分光光度计法
RNA得率有很强的组织特异性，不同组织RNA的丰度和RNA提取的
难易程度共同决定了该种组织的RNA得率。一般来说，可通过分光
光度计测定RNA溶液在260nm处的吸光值来计算RNA的含量。RNA
溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、溶液
浑浊度、杂质（多肽、苯酚等）浓度和蛋白等有机物的吸收值。用标
准样品测得在波长260nm处，1μg/ml RNA钠盐吸光度为0.025（光
程为1cm），即OD260=1时，样品中RNA浓度为40μg/ml。通常分光
光度计OD260的读数要介于0.15-1.0之间才是可靠的，因此RNA提
取结束后，要根据大概产量稀释到适当浓度范围，再用分光光度计
检测。按下面的公式计算总RNA浓度：
总RNA浓度（μg/ml）= OD260×稀释倍数× 40μg/ml
RNA纯度检测——分光光度计法
通过OD260/280来检测RNA纯度，OD260/230作为参考值。
OD260/280在1.9-2.1之间，可以认为RNA的纯度较好；
OD260/280值小于1.8，则表明蛋白杂质较多；
OD260/280值大于2.2，则表明RNA已经降解；
OD260/230值小于2.0，则表明裂解液中有异硫氰酸胍和β-巯基乙
醇残留。
注意：如果用TE溶解或洗脱RNA，会使OD260/280值偏大。
RNA完整性鉴定——琼脂糖凝胶电泳
变性电泳：
我们可以通过RNA变性电泳，来鉴定RNA的完整性，但一般情况
下常规电泳检测即可。
RNA变性电泳方法如下：
1、凝胶制备：1.2％琼脂糖凝胶
2、上样电泳
①电泳混合液的制备：
10×甲醛变性电泳缓冲液 1.25ul
37％甲醛 2.2ul
甲酰胺 6.25ul
②加入RNA
③混合后1000-2000rpm离心5-10秒
④55℃加热15分钟
⑤加入2.5 μ l甲醛凝胶上样缓冲液，混合后离心5秒
⑥将样品加入点样孔
⑦在5 V/cm的电压下电泳至溴酚蓝带跑到电泳槽中央（20cm长电
泳槽，95V电压，1小时左右）。
rRNA占总RNA的80-85％，在琼脂糖凝胶上可以清晰地看到
28S（23S）和18S（16S）rRNA。如28S rRNA的量约为18S rRNA的两
倍，说明RNA完整性较好。
常规电泳：
由于变性电泳操作步骤较为复杂，所以在要求不太严格的实验
中，RNA的检测可以通过常规的琼脂糖凝胶电泳进行。一般1％
左右的凝胶就可以。按常规电泳配制好凝胶和电泳溶液，总RNA
在普通琼脂糖凝胶电泳上显示条带与变性电泳一致。