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RNA评价与鉴定

发表时间:2010-01-26  |  点击率:6046

RNA评价与鉴定
提取得到RNA溶液后,我们需要对RNA进行相关的质量检测,以确
定它是否符合后续实验的要求。RNA用于不同的后续实验,对其质
量要求不尽相同。cDNA文库构建要求RNA完整且无酶等抑制物残
留;Northern blot实验对RNA完整性要求较高,对酶反应抑制物残
留要求较低;RT-PCR实验对RNA完整性要求不太高,但对酶反应
抑制物残留要求严格。因此在进行不同的实验时应选择不同的方法
纯化RNA,以达到佳的实验效果。
RNA得率检测——分光光度计法
RNA得率有很强的组织特异性,不同组织RNA的丰度和RNA提取的
难易程度共同决定了该种组织的RNA得率。一般来说,可通过分光
光度计测定RNA溶液在260nm处的吸光值来计算RNA的含量。RNA
溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、溶液
浑浊度、杂质(多肽、苯酚等)浓度和蛋白等有机物的吸收值。用标
准样品测得在波长260nm处,1μg/ml RNA钠盐吸光度为0.025(光
程为1cm),即OD260=1时,样品中RNA浓度为40μg/ml。通常分光
光度计OD260的读数要介于0.15-1.0之间才是可靠的,因此RNA提
取结束后,要根据大概产量稀释到适当浓度范围,再用分光光度计
检测。按下面的公式计算总RNA浓度:
总RNA浓度(μg/ml)= OD260×稀释倍数× 40μg/ml
RNA纯度检测——分光光度计法
通过OD260/280来检测RNA纯度,OD260/230作为参考值。
OD260/280在1.9-2.1之间,可以认为RNA的纯度较好;
OD260/280值小于1.8,则表明蛋白杂质较多;
OD260/280值大于2.2,则表明RNA已经降解;
OD260/230值小于2.0,则表明裂解液中有异硫氰酸胍和β-巯基乙
醇残留。
注意:如果用TE溶解或洗脱RNA,会使OD260/280值偏大。
RNA完整性鉴定——琼脂糖凝胶电泳
变性电泳:
我们可以通过RNA变性电泳,来鉴定RNA的完整性,但一般情况
下常规电泳检测即可。
RNA变性电泳方法如下:
1、凝胶制备:1.2%琼脂糖凝胶
2、上样电泳
①电泳混合液的制备:
10×甲醛变性电泳缓冲液 1.25ul
37%甲醛 2.2ul
甲酰胺 6.25ul
②加入RNA
③混合后1000-2000rpm离心5-10秒
④55℃加热15分钟
⑤加入2.5 μ l甲醛凝胶上样缓冲液,混合后离心5秒
⑥将样品加入点样孔
⑦在5 V/cm的电压下电泳至溴酚蓝带跑到电泳槽中央(20cm长电
泳槽,95V电压,1小时左右)。
rRNA占总RNA的80-85%,在琼脂糖凝胶上可以清晰地看到
28S(23S)和18S(16S)rRNA。如28S rRNA的量约为18S rRNA的两
倍,说明RNA完整性较好。
常规电泳:
由于变性电泳操作步骤较为复杂,所以在要求不太严格的实验
中,RNA的检测可以通过常规的琼脂糖凝胶电泳进行。一般1%
左右的凝胶就可以。按常规电泳配制好凝胶和电泳溶液,总RNA
在普通琼脂糖凝胶电泳上显示条带与变性电泳一致。

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