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柠檬酸合酶测试盒 常量可见分光光度法 说明 技术 文章

发表时间:2019-04-02  |  点击率:343

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柠檬酸合酶(Citrate Synthase,CS)试剂盒

商品货号:QS1005
英文名称:Citrate Synthase(CS)Assay Kit
别名:柠檬酸合酶试剂盒 CS Kit 柠檬酸合酶(CS)试剂盒 柠檬酸合酶(CS)测试盒,生化法试剂盒
检测方法:常量法

 

商品货号:商品品牌:规格基本售价选择规格
QS1005-25管/24样 25管/24样¥2000.00元 
QS1005-50管/48样 50管/48样¥3200.00元 

测定意义:                           

CS(EC 2.3.3.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,是三羧酸循环个限速酶,是三羧酸循环主要调控位点之一。

测定原理:

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A,进一步水解产生柠檬酸;该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB,在 412nm处有特征吸光值。

 

货号:QS1005-25                                                   规格:25管/24样

柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)试剂盒说明书

可见分光光度法

注意:正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:                          

CS(EC 2.3.3.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,是三羧酸循环个限速酶,是三羧酸循环主要调控位点之一。

测定原理:

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A,进一步水解产生柠檬酸;该反应促使无色的DTNB转变成黄色的TNB,在 412nm处有特征吸光值。

自备实验用品及仪器:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

试剂组成和配制:

试剂一:液体25mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二:液体5mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三:液体0.5mL×1支,-20℃保存;

试剂四:液体25mL×1瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×1支,4℃保存,临用前加入800μL无水乙醇,用不完的试剂4℃保存一周;

试剂六:粉剂×2支,-20℃保存,临用前加入400μL蒸馏水,用不完的试剂仍-20℃保存;

试剂七:粉剂×1支,-20℃保存,临用前加入800μL蒸馏水,用不完的试剂仍-20℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

  • 称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
  • 将匀浆600g,4℃离心5min。
  • 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
  • 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的CS(此步可选做)。
  • 在步骤④中的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体CS测定。

测定步骤:

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至412nm,蒸馏水调零。

2、将试剂四、五、六和七在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。

3、样本测定

试剂名称(μL)

测定管

试剂四

780

试剂五

30

试剂六

30

样本

30

试剂七

30

将上述试剂按顺序加入1 mL玻璃比色皿中,加试剂七的同时开始计时,在412nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和反应2min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。

CS活性计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CS(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=222.2×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CS(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.4444×ΔA

V反总:反应体系总体积,9×10-4 L;ε:TNB摩尔消光系数,1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.03 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

 

 

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