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丙酮酸脱羧酶(PDC)测试盒 常量可见分光光度法 说明 技术 文章

发表时间:2019-04-03  |  点击率:457

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丙酮酸脱羧酶( Pyruvate Decarboxylase,PDC ) 活性测定试剂盒

商品货号:QS1006
英文名称:Pyruvate Decarboxylase (PDC) Assay Kit
别名:丙酮酸脱羧酶试剂盒 PDC Kit 丙酮酸脱羧酶(PDC)试剂盒 丙酮酸脱羧酶(PDC)测试盒
检测方法:常量法

 

商品货号:商品品牌:规格基本售价选择规格
QS1006-50管/48样 50管/48样¥720.00元 

测定意义:

PDC主要存在于酵母中,是乙醇发酵的关键酶之一,催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

测定原理:

PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛,添加乙醇脱氢酶(ADH)来进一步催化 NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+;NADH在340 nm有吸收峰,而NAD+没有;通过测定340 nm光吸收下降速率,来计算PDC活性。

 

货号: QS1006                                                      规格:50管/48样丙酮酸脱羧酶( pyruvate decarboxylase,PDC )

活性测定试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

PDC主要存在于酵母中,是乙醇发酵的关键酶之一,催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

测定原理:

PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛,添加乙醇脱氢酶(ADH)来进一步催化 NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+;NADH在340 nm有吸收峰,而NAD+没有;通过测定340 nm光吸收下降速率,来计算PDC活性。

自备实验用品及仪器:

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体50mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:液体36mL×1瓶,4℃保存。

试剂三:液体5mL×1瓶,4℃保存。

试剂四:粉剂×1支,﹣20℃保存。

试剂五:液体60μL×1支,﹣20℃保存。

混合试剂:临用前配制,将试剂四和试剂五转移至试剂三中充分溶解待用,用不完的试剂

          分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂六:液体5mL×1瓶,4℃保存。

粗酶液提取:

1、细菌或细胞处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每200万细菌或细胞加入400μL试剂一,超声波破碎细菌或细胞(功率200W,工作3s,间歇10s,工作35次),16000g 4℃离心20min,取上清,置冰上待测。

2、组织处理:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆,16000g 4℃离心20min,取上清,置冰上待测。

3、血清(浆)等液体样品:直接检测。

PDC测定操作:

1. 分光光度计预热30min,调节波长到340 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二置于25℃水浴中预热30 min。

3. 空白管:依次在1mL石英比色皿中加入100μL蒸馏水、100μL混合试剂、700μL试剂二和100μL试剂六,迅速混匀后于340nm比色,记录15s和75s的吸光值,分别记为A1和A2。

4. 测定管:依次在1mL石英比色皿中加入100μL上清液、100μL混合试剂、700μL试剂二和100μL试剂六,迅速混匀后于340nm比色,记录15s和75s的吸光值,分别记为A3和A4。

注意:空白管只需测定一次。

PDC活性计算公式:

(1)按照蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃中,每毫克蛋白每分钟催化1μmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (μmol/min/mg prot) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V总×106}÷(Cpr×V样) ÷T

=1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义:25℃中,每克组织每分钟催化1μmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (μmol/min /g鲜重) =÷(W×V样÷V样总) ÷T

=1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:25℃中,每104个细胞每分钟催化1μmol NADH 氧化为1个酶活单位。

PDC (μmol/min/104cell) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷ε÷d×V总×106}÷(细胞数量×V样÷V样总) ÷T

=1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷细胞数量

(4)按血清(浆)体积计算

活性单位定义:25℃中,每毫升血清(浆)每分钟催化1μmol NADH 氧化为1个酶活单位。PDC (μmol/min /mL) =÷V样÷÷T

=1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]

ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V总:反应体系总体积,1mL=0.001 L,V样:加入反应体系中上清液体积,0.1mL;Cpr:蛋白浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒;W:样本质量,g ;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1 min。

 

辅酶Ⅰ系列    
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