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用于检测未知抗体的间接法

发表时间:2012-06-04  |  点击率:1815

  用于检测未知抗体的间接法:

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml, 每孔加0.1ml,
4℃过夜。次日洗涤3次。
              ↓
加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,
置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照) 于反
应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37℃孵育
30-60分钟,洗涤,后一遍用DDW洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
操作要点:
1 标本的准备
可用作ELISA测定的标本十分广泛,体液(如血清)、分泌物(唾
液)和排泄物(如尿液、粪便)等均可作标本以测定其中某种抗体
或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液),有些
则需经预处理(如粪便和某些分泌物)
2 试剂的准备
按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏
水或去离子水,包括用于洗涤的盐,应为新鲜和高品质的。自配的
缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与
室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱
保存。
3 加样
在ELISA中一般有3次加样步聚,即加标本,加酶结合物,加底物。
加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并
注意不可溅出,不可产生气泡。
加标本一般用微量加样器,按规定的量加入板孔中。每次加标本应
更换吸嘴,以免发生交叉污染。有时测定(如间接法ELISA)需用稀
释的血清,可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔
中加入稀释液,再在其中加入血清标本,然后在微型震荡器上震荡
1分钟以保证混和。加酶结合液和底物反应液时可用定量多道加液
器,使加液过程迅速完成。
4 保温
在ELISA中一般有两次抗原抗体反应,即加标本和加酶结合物后。
抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间,这一保温过程称为
温育。
ELISA属固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。
以抗体包被的夹心法为例,加入板孔中的标本,其中的抗原并不是
都有均等的和固相抗体结合的机会,只有贴近孔壁的一层溶液中
的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程,因此需经扩散
才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合
也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。
温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。37℃
是实验室中常用的保温温度,也是大多数抗原抗体结合的合适温
度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时,实验表明,两次抗原
抗体反应一般在37℃经1-2小时,产物的生成可达顶峰。为加速反
应,可提高反应的温度,有些试验在43℃进行,但不宜采用更高的
温度。抗原抗体反应4℃更为彻底,在放射免疫测定中多使反应在
冰箱中过夜,以形成多的沉淀。但因所需时间太长,在ELISA中
一般不予采用。
保温的方式除某些ELISA仪附有特制的电热块外,一般均采用水
浴,可将ELISA板置于水浴箱中,ELISA板底应贴着水面,使温度
迅速平衡。为避免蒸发,板上应加盖,也可用塑料贴封纸或保鲜
膜覆盖板孔,此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱,ELISA
板应放在湿盒内,湿盒要选用传热性良好的材料如金属等,在盒底
垫湿的纱布,后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱
中预温至规定的温度,特别是在气温较低的时候更应如此。无论是
水浴还是湿盒温育,反应板均不宜叠放,以保证各板的温度都能迅
速平衡。室温温育的反应,操作时的室温应严格限制在规定的范围
内,标准室温温度是指20-25℃,但具体操作时可根据说明书的要
求控制温育。室温温育时,ELISA板只要平置于操作台上即可。应
注意温育的温度和时间应按规定力求准确。
5 洗涤
洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤,但却也决定着实验的成
败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目
的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物
质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚
苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时又应把这种
非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中,洗涤
是主要的关键技术,应引起操作者的高度重视,操作者应严格按
要求洗涤,不得马虎。
洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外,手工操作
一般用浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液;b.用洗涤液过洗一遍(将
洗涤液注满板孔后,即甩去);c.浸泡,即将洗涤液注满板孔,放置
1-2分钟,间歇摇动,浸泡时间不可随意缩短;d.吸干孔内液体。
吸干应彻底,可用水泵或真空泵抽吸,也可甩去液体后在清洁毛巾
或吸水纸上拍干;e.重复操作c和d,洗涤3-4次(或按说明规定)。在
间接法中如本底较高,可增加洗涤次数或延长浸泡时间。
6 显色和比色
(1) 显色
显色是ELISA中的后一步温育反应,此时酶催化无色的底物生成
有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间
内,阴性孔可保持无色,而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适
当提高温度有助于加速显色进行。在定量测定中,加入底物后的反
应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行,
时间一般不需要严格控制,有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的
显色情况适当缩短或延长反应时间,及时判断。
OPD底物显色一般在室温或37℃反应20-30分钟后即不再加深,再
延长反应时间,可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色,
显色反应应避光进行,显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD
产物用硫酸终止后,显色由橙黄色转向棕黄色。
TMB受光照的影响不大,可在室温中置于操作台上,边反应边观
察结果。但为保证实验结果的稳定性,宜在规定的适当时间阅读结
果。TMB经HRP作用后,约40分钟显色达顶峰,随即逐渐减弱,
至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种,叠氮钠和
十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚
能使蓝色维持较长时间(12-24小时)不褪,是目视判断的良好终止
剂。此外,各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色,此时可用特定
的波长(450nm)测读吸光值。
(2) 比色
比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体,然后将板正确放
入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验,需先将板置于标
准96孔的座架中,才可进行比色。好在加底物液显色前,先将软
板边缘剪净,这样,此板就可完全平妥坐入座架中。
比色时应先以蒸馏水校零点,测读底物孔(未经任何反应仅加底物液
的孔)和空白孔(以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔),以记
录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点,以上各
孔的吸光度需减去空白孔的吸光度,然后进行计算。
比色结果的表达以往通用光密度(oplical density,OD),现按规定用
吸光度(absorbence,A),两者含义相同。通常的表示方法是,将吸
收波长写于A字母的右下角,如OPD的吸收波长为492nm,表示方
法为"A492nm"或"OD492nm"。
(3) 酶标比色仪
酶标比色仪简称酶标仪,通常指于测读ELISA结果吸光度的光
度计。针对固相载体形式的不同,各有特制的适用于板、珠和小试
管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指
标有:测读速度、读数的准确性、重复性、度和可测范围、
线性等等。优良的酶标仪的读数一般可到0.001,准确性为±
1%,重复性达0.5%。举例说,若某孔测得的A值为1.083,则该孔
相对于空气的真实A值应为1.083±0.01(1.073~1.093),重复测定
数次,其A值均应1.083±0.05(1.078~1.088)在之间。酶标仪的可
测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在0.000~2.000,
新型号的酶标仪上限拓宽达2.900,甚至更高。超出可测上限的A
值常以"*"或"over"或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的
不同,线性范围常小于可测范围,比如某一酶标仪的可测范围为
0.000~2.900,而其线性范围仅0.000~2.000,这在定量ELISA中制
作标准曲线时应予注意。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下,操
作时室温宜在15~30℃,使用前先预热仪器15-30分钟,测读结果
更稳定。测读A值时,要选用产物的敏感吸收峰,如OPD用492nm
波长。有的酶标仪可用双波长式测读,即每孔先后测读两次,*
次在适波长(W1),第二次在不敏感波长(W2),两次测定间不移动
ELISA板的位置。例如OPD用492nm为W1,630nm为W2,终测
得的A值为两者之差(W1-W2)。双波长式测读可减少由容器上的划
痕或指印等造成的光干扰。各种酶标仪性能有所不同,使用中应详
细阅读说明书。

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